麻楝果实化学成分及其抗烟草青枯病菌活性的研究

刘 慧，刘寿柏，王 昊，陈惠琴，王 佩，梅文莉，杨克军，戴好富*

1黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163000；2中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101；3海南大学热带农林学院，海口 570228

麻楝(ChukrasiatabularisA.Juss.)属于楝科(Meliaceae)桃花心木亚科(Subfam.Swietenioideae)麻楝属(Chukrasia)。该属仅包括麻楝原种和其变种毛麻楝(Chukrasiatabularisvar.velutina)[1]。麻楝主要分布于亚洲热带地区，在我国海南、广东、广西、云南等地均有分布，别名为阴麻树、白皮香椿。据文献报道，三萜类化合物是楝科植物的主要化学成分[2]。迄今，国内外对麻楝化学成分及生物活性方面的研究集中于根、茎、叶上[3，4]，对果实部分的研究报道较少。麻楝中的化学成分主要为柠檬苦素型三萜[3]，除此之外，还含有甘遂烷型三萜、酚类和香豆素等类型化合物[4]。本次试验对麻楝果实乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分的化学成分进行了研究，旨在筛选出麻楝果实中的生物活性成分，为麻楝的开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

旋转蒸发仪EYELA N-1300(上海爱朗仪器有限公司)；安捷伦1260分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；半制备高效液相色谱仪SUMMIT P680A(美国Dionex公司)；质谱仪VG Autospec-3000(英国VG公司)；核磁共振仪Bruker AV-500(瑞士Bruker公司，TMS内标)；实验室纯水系统 Spring-R10(厦门锐思捷水纯化技术有限公司)。

薄层层析硅胶板、柱色谱硅胶(200～300目)(青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司)；反相材料RP-18(日本Fuji Silysia公司)。

麻楝果实于2014年7月采自海南省海口市，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所王军博士鉴定为麻楝属植物麻楝(ChukrasiatabularisA.Juss.)的果实，凭证标本(No.20140726)现存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

2 实验方法

2.1 提取与分离

将麻楝果实(16.0 kg)晒干后粉碎，室温下用95%乙醇浸提3次，每次7天。所得浸提液过滤后经减压浓缩得乙醇粗浸膏，随后将其分散于水中成悬浊液，再依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别经减压浓缩得到乙酸乙酯相3 390.0 g、正丁醇相208.0 g。

乙酸乙酯相(3 390.0 g)采用正相硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(20:1～0:1)梯度洗脱，分段收集得到15个流份(Fr.1～Fr.15)。Fr.5(6.1 g)经Sephadex LH-20柱色谱(氯仿∶甲醇=1∶1)分离得到4个流份Fr.5-1～ Fr.5-4。Fr.5-4经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物4(3.2 mg)和5(10.3 mg)。Fr.6(21.0 g)经重结晶得到化合物15(18.0 mg)；剩余样品采用RP-18反相柱色谱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，分段收集得到20个流份(Fr.6-1～ Fr.6-20)。Fr.6-13(516.8 mg)经Sephadex LH-20柱色谱(氯仿∶甲醇=1∶1)分离得到3个流份Fr.6-13-1～ Fr.6-13-3。Fr.6-13-3经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物9(14.5 mg)、12(23.0 mg)和14(15.6 mg)。Fr.6-14(992.1 mg)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离得到2个流份Fr.6-14-1和 Fr.6-14-2。Fr.6-14-1经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物7(2.7 mg)和13(6.3 mg)。Fr.6-15(321.4 mg)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离得到3个流份Fr.6-15-1～ Fr.6-15-3。Fr.6-15-2经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物6(7.3 mg)、8(13.4 mg)、10(4.6 mg)和11(3.7 mg)。Fr.13(32.0 g)经重结晶及半制备型高效液相色谱仪(C18柱；45%甲醇酸水，流速4 mL/min)分离得到化合物1(43.1 mg)、2(4.0 mg)和3(15.8 mg)。

2.2 抗烟草青枯病菌活性测试

采用滤纸片琼脂扩散法[5]测定样品的抗烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)活性。用棉签将烟草青枯病菌菌株均匀涂布后，选用直径为6 mm的灭菌滤纸片，在其上加入10 μL的样品溶液，待有机溶剂挥干后置于含菌平板上，每个平板放置5个滤纸片。28 ℃条件下恒温培养12 h后观察测试结果，用游标卡尺测量并记录各抑菌圈直径。

3 结果与分析

3.1 结构鉴定

化合物1白色固体(CH3OH);ESI-MS:m/z183.2 [M-H]-;分子式为C8H8O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6),3.76 (3H,s,7-OCH3);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.3 (C-1),110.0 (C-2,C-6),146.4 (C-3,C-5),139.7 (C-4),169.0 (C-7),52.3 (7-OCH3)。以上波谱数据与文献[6]报道基本一致，故该化合物鉴定为没食子酸甲酯 。

化合物2白色固体(CH3OH);ESI-MS:m/z197.2 [M-H]-;分子式为C9H10O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6),4.23 (2H,q,J=7.1 Hz,7-OCH2CH3),1.30 (3H,t,J=7.1 Hz,7-OCH2CH3);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.7 (C-1),109.9 (C-2,C-6),146.5 (C-3,C-5),139.7 (C-4),168.5 (C-7),61.7 (7-OCH2CH3),14.6 (7-OCH2CH3)。以上波谱数据与文献[7]报道基本一致，故该化合物鉴定为没食子酸乙酯。

化合物3白色晶体(CH3OH);ESI-MS:m/z169.2 [M-H]-;分子式为C7H6O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.9 (C-1),110.3 (C-2,C-6),146.3 (C-3,C-5),139.6 (C-4),170.4 (C-7)。以上波谱数据与文献[6]报道基本一致，故该化合物鉴定为没食子酸。

化合物15白色无定形粉末(CHCl3);ESI-MS:m/z723.5 [M + Na]+;分子式为C37H48O13;1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:7.52 (1H,s,H-21),7.41 (1H,t,J=1.6 Hz,H-23),6.45 (1H,br d,J=1.1 Hz,H-22),5.90 (1H,s,H-30),5.53 (1H,s,H-17),4.65 (1H,s,H-3),3.69 (3H,s,7-OCH3),3.23 (1H,dd,J=1.0,20.0 Hz,H-15a),2.95 (1H,dd,J=9.2,2.6 Hz,H-5),2.81 (1H,m,H-2″),2.69 (1H,dd,J=10.6,20.0 Hz,H-15b),2.55 (1H,m,H-2′),2.45 (1H,dd,J=15.9,9.3 Hz,H-6a),2.26 (1H,dd,J=15.9,2.7 Hz,H-6b),2.05 (2H,m,overlapped,H-11a,H-14),1.88 (1H,d,J=10.8 Hz,H-29a),1.73 (1H,d,J=10.8 Hz,H-29b),1.66 (3H,s,H-32),1.62 (2H,m,overlapped,H-11b,H-12a),1.28 (1H,m,H-12b),1.22 (3H,d,J=7.2 Hz,H-4′),1.18 (3H,d,J=7.2 Hz,H-4″),1.16 (3H,d,J=6.8 Hz,H-3″),1.13 (3H,s,H-19),1.07 (3H,d,J=6.8 Hz,H-3′),1.04 (3H,s,H-18),0.90 (3H,s,H-28);13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:87.3 (C-1),79.9 (C-2),83.2 (C-3),45.5 (C-4),36.9 (C-5),33.8 (C-6),173.0 (C-7),86.5 (C-8),85.7 (C-9),45.4 (C-10),25.4 (C-11),29.2 (C-12),34.6 (C-13),42.9 (C-14),26.7 (C-15),170.5 (C-16),78.6 (C-17),19.8 (C-18),16.4 (C-19),121.3 (C-20),140.8 (C-21),109.8 (C-22),143.0 (C-23),14.6 (C-28),39.6 (C-29),70.7 (C-30),119.1 (C-31),21.3 (C-32),52.2 (7-OCH3),3-isobutyryloxyl [ 176.8 (C-1′),34.7 (C-2′),18.1 (C-3′),19.7 (C-4′)],30-isobutyryloxyl [ 175.1 (C-1′′),34.6 (C-2′′),18.4 (C-3′′),19.5 (C-4′′)]。以上波谱数据与文献[20]报道基本一致，故该化合物鉴定为phragmalin 3,30-di-isobutyrate。

3.2 活性分析

采用滤纸片琼脂扩散法测定麻楝乙酸乙酯萃取物及单体化合物1～15的抗烟草青枯病菌活性。结果表明，乙酸乙酯萃取物在10 mg/mL浓度下对烟草青枯病菌具有中等拮抗活性(抑菌圈直径为14.76 mm)，化合物1、2和3具有一定的拮抗活性，化合物4～15均无明显拮抗活性，活性结果如表1所示。

表1化合物1～15(1mg/mL)对烟草青枯病菌的拮抗活性

Table 1 Inhibitory activity of compounds1-15(1 mg/mL) againstRalstoniasolanacearum

注:卡那霉素为阳性对照(1 mg/mL)。

Note:Kanamycin as positive control (1 mg/mL).

4 讨论

本文采用多种柱色谱技术，从麻楝果实乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分离鉴定了15个单体化合物，分别鉴定为：没食子酸甲酯(1)、没食子酸乙酯(2)、没食子酸(3)、ozoroalide(4)、stigmast-4-en-6β-ol-3-one(5)、黄柏呈(6)、chukranin A(7)、chisopanin M(8)、21α,24α-methylmelianodiol(9)、toonaciliatin K(10)、21α,25-dimethylmelianodiol(11)、odoratone(12)、bourjotinolone A(13)、hispidone(14)和phragmalin di-isobutyrate(15)，包括9个甘遂烷型三萜，1个柠檬苦素型三萜，1个甾体和4个酚性化合物，其中化合物4～14为首次从麻楝属植物中分离得到。麻楝植物根、茎、叶部分的化学成分研究报道多为柠檬苦素型三萜[3，4]，而本次研究发现麻楝果实中含有较多的甘遂烷型三萜和酚性化合物。本研究结果丰富了麻楝中化学成分的结构多样性，并且首次对该属植物中分离得到的单体化合物进行了抗烟草青枯病菌活性的研究，结果发现化合物1、2和3具有中等的烟草青枯病菌拮抗活性，这为麻楝的开发利用提供了科学依据。