番石榴叶化学成分分离鉴定及psiguadial D的抗癌活性研究

任善亮，吴 茂，徐露林，刘晓聪，雷思敏，海 萍，杨小龙2,*，高 原*

1宜宾学院化学与化工学院，宜宾 644000；2中南民族大学药学院，武汉 430074；3重庆大学药学院创新药物研究中心，重庆 401331

番石榴(Psidiumguajava)是桃金娘科(Myrtaceae)番石榴属植物，广泛分布于热带和亚热带地区，民间用于治疗炎症、糖尿病、高血压、发热、呕吐、腹泻[1-3]。番石榴叶是一种次生代谢产物具有极高“创造系数”和显著活性的生物资源。文献研究表明，含有3,5-二甲酰基苄基间苯三酚特征结构单元的混源杂萜是从该植物叶中发现的一类特有结构，这种苄基间苯三酚结构单元能够与萜烯、黄酮杂合形成多种新颖骨架[3-14]，其中guajadial[7]、psiguadial A[7]、psiguadial B[7]、psiguadial C[8]、psiguadial D[8]对人体肝癌细胞HepG2显示出很强的抑制作用(IC50=45.62～157.90 nmol/L)。为进一步研究番石榴的药用物质基础，本文对我国云南产番石榴叶的化学成分进行了系统分离，得到了13个化合物，分别鉴定为4,5-diepipsidial A(1)、psidial A(2)、guajadial(3)、psiguadial A(4)、psiguadial D(5)、α-生育酚(6)、亚油酸(7)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷(8)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(9)、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(10)、β-谷甾醇(11)、儿茶素(12)、没食子酸(13)。其中，化合物1为首次从天然产物中分离得到，化合物5对5种人体肿瘤细胞株HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480显示出较为明显的抑制活性。

1 仪器和材料

1.1 仪器与试剂

核磁共振光谱仪(Bruker AV-400 MHz和AV-500 MHz)；ZF-1型紫外检测仪(力辰仪器科技有限公司生产)；RE52C型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-3型循环式多用真空泵(郑州长城仪器有限公司)；FA1604A型电子分析天平(河南恒信仪器设备有限公司)；HSGF254薄层层析硅胶厚制备板(HPTLC,8 ± 2 μm ≥ 80%,0.4～0.5 mm，烟台江友硅胶开发有限公司)；柱层析正相硅胶(200～300目，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)；半制备型HPLC(AS20005,Dubhe C18column,10 μm,20 × 250 mm，江苏汉邦科技有限公司)；Sephadex LH-20(Amersham Biosciences,Sweden)。

1.2 实验材料

番石榴叶于2017年9月采自云南省丽江市华坪县大兴乡，原植物由中国科学院昆明植物研究所陈渝鉴定为桃金娘科番石榴属植物番石榴Psidiumguajava，样品标本存放于宜宾学院化学与化工学院。

2 提取与分离

干燥的番石榴叶5 kg，用95%甲醇在室温下浸泡提取3次，每次48 h；合并浓缩后，得到浸膏500 g。用硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯(95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，0∶100，甲醇)梯度洗脱，TLC检测合并后得到10个组分Fr 1-10。Fr 2经反复硅胶(石油醚-乙酸乙酯，100∶1→20∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱色谱，及TLC(石油醚-乙酸乙酯-甲酸，50∶2∶0.1)制备，得到化合物1(4 mg)、2(14 mg)、3(45 mg)、4(48 mg)、5(3 mg)。Fr 3经过正相硅胶(石油醚-乙酸乙酯，20∶1→5∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱层析分离，得到化合物6(22 mg)和7(54 mg)。Fr 4经正相硅胶(石油醚-乙酸乙酯，5∶1)柱层析分离，得到化合物11(716 mg)。Fr 5经过正相硅胶(二氯甲烷-甲醇，20∶1→6∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱层析分离，得到化合物12(68 mg)和13(144 mg)。Fr 8经过正相硅胶(二氯甲烷-甲醇，10∶1→5∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱层析，及HPLC(甲醇-水，40%→65%，0 min→30 min，10 ml/min)制备分离，得到化合物8(5 mg，tR=22.3 min)、9(4 mg，tR=22.9 min)、10(6 mg，tR=24.0 min)。

3 结构鉴定

化合物1白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ: 13.48 (1H,s,5′-OH),13.09 (1H,s,7′-OH),10.08 (1H,s,H-14′),10.07 (1H,s,H-15′),7.17～7.30 (5H,m,H-9′,H-10′,H-11′,H-12′,H-13′),4.60 (1H,s,H-15a),4.59 (1H,s,H-15b),3.42 (1H,d,J=10.3 Hz,H-1′),2.29 (1H,dt,J=10.3,4.8 Hz,H-5),2.20 (1H,m,H-9),2.16 (1H,m,H-3a),2.04 (1H,dd,J=13.3,9.2 Hz,H-7a),1.80 (1H,dt,J=14.7,3.9 Hz,H-3b),1.69 (1H,m,H-6a),1.64 (1H,dd,J=10.6,8.2 Hz,H-10a),1.56 (1H,m,H-2a),1.56 (1H,m,H-10b),1.54 (1H,m,H-1),1.47 (1H,m,H-6b),1.20 (3H,s,H3-14),1.05 (1H,m,H-7b),0.99 (6H,s,H3-12,H3-13);13C NMR (CDCl3,125 MHz) (:192.2 (d,C-14′),191.5 (d,C-15′),169.4 (s,C-7′),168.4 (s,C-5′),163.6 (s,C-3′),154.9 (s,C-8),144.1 (s,C-8′),128.4 (s,C-10′,C-12′),128.0 (s,C-9′,C-13′),126.4 (s,C-11′),109.6 (t,C-15),104.9 (s,C-2′),104.2 (s,C-6′),104.1 (s,C-4′),84.7 (s,C-4),57.4 (d,C-1),44.3 (d,C-1′),43.8 (d,C-5),42.1 (d,C-9),38.7 (t,C-10),38.2 (t,C-3),37.2 (t,C-7),33.6 (t,C-6),33.2 (s,C-11),29.5,22.42 (d,C-12,C-13),22.36 (s,C-2),20.1 (s,C-14)。以上数据与文献[15]对照基本一致，故确定化合物1为4,5-diepipsidial A。

化合物2白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.43 (1H,s,H-7′),13.09 (1H,s,H-5′),10.14 (1H,s,H-15′),10.10 (1H,s,H-14′),7.26 (2H,t,J=7.0 Hz,H-10′,H-12′),7.23 (1H,t,J=7.0 Hz,H-11′),7.15 (2H,d,J=7.2 Hz,H-9′,H-13′),5.03 (1H,s,H-15b),5.00 (1H,s,H-15a),4.18 (1H,d,J=5.7 Hz,H-1′),2.57 (1H,dt,J=3.8,13.5 Hz,H-7b),2.42 (1H,m,H-9),2.27 (1H,brd,J=13.5 Hz,H-7a),2.10 (1H,dd,J=13.9,9.3 Hz,H-3b),2.05 (1H,ddd,J=9.5,5.7,2.0 Hz,H-5),1.79 (1H,t,J=10.1 Hz,H-10a),1.62 (1H,m,H-2a),1.60 (1H,m,H-10b),1.53 (1H,m,H-3a),1.47 (1H,m,H-1),1.44～1.62 (2H,m,H2-6),1.38 (1H,m,H-2b),1.16 (3H,s,H3-14),0.98 (3H,s,H3-12),0.96 (3H,s,H3-13)。以上数据与文献[6,15]对照基本一致，故确定化合物2为psidial A。

化合物3白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.44 (1H,s,5′-OH),13.06 (1H,s,7′-OH),10.09 (1H,s,H-14′),10.06 (1H,s,H-15′),7.12～7.28 (3H,m,H-10′,H-11′,H-12′),7.11 (2H,d,J=7.2 Hz,H-9′,H-13′),4.54 (1H,s,H-15a),4.03 (1H,s,H-15b),3.38 (1H,d,J=10.3 Hz,H-1′),2.32 (1H,m,H-9),2.23 (1H,m,H-5),2.16 (1H,m,H-3a),1.97 (1H,m,H-3b),1.80～2.00 (4H,m,H-1,H2-7,H-2a),1.68 (1H,m,H-6a),1.50～1.65 (3H,m,H-6b,H2-10),1.45 (1H,m,H-2b),1.26 (3H,s,H3-14),1.01 (3H,s,H3-12),0.98 (3H,s,H3-13)。以上数据与文献[15]对照基本一致，故确定化合物3为guajadial。

化合物4白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.77 (1H,s,5′-OH),13.54 (1H,s,7′-OH),10.38 (1H,s,H-14′),10.11 (1H,s,H-15′),7.21 (2H,m,H-10′,H-12′),7.13 (2H,m,H-9′,H-13′),7.11 (1H,m,H-11′),4.48 (1H,s,H-1′),2.49 (1H,m,H-10),2.34 (1H,d,J=11.3 Hz,H-5),2.01 (1H,m,H-2a),1.93 (1H,m,H-9β),1.90 (1H,m,H-3a),1.88 (1H,m,H-2b),1.83 (1H,m,H-8β),1.74 (1H,m,H-9α),1.63 (1H,m,H-3b),1.25 (1H,m,H-8α),1.12 (3H,s,H3-15),1.09 (3H,d,J=7.1 Hz,H3-14),0.90 (3H,s,H3-12),0.57 (1H,m,H-7),0.28 (1H,t ,J=10.3 Hz,H-6),0.22 (3H,s,H3-13)。以上数据与文献[7]对照基本一致，故确定化合物4为psiguadial A。

化合物5白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.60 (1H,s,5′-OH),13.15 (1H,s,7′-OH),10.10 (1H,s,H-14′),10.08 (1H,s,H-15′),7.32 (2H,m,H-12′,H-13′),7.23 (1H,m,H-11′),7.15 (1H,t,J=7.4 Hz,H-10′),6.78 (1H,d,J=7.7 Hz,H-9′),5.27 (1H,brd,J=11.2 Hz,H-1),4.36 (1H,s,H-1′),3.70 (1H,d,J=7.1 Hz,H-5),2.75 (1H,m,H-2a),2.08 (1H,m,H-2b),2.08 (2H,m,H2-9),1.90 (1H,brd,J=13.3 Hz,H-8a),1.70 (3H,s,H3-14),1.18 (3H,s,H3-12),1.11 (3H,s,H3-13),0.96 (1H,d,J=13.3 Hz,H-8b),0.92 (1H,t,J=7.7 Hz,H-6),0.70 (3H,s,H3-15),0.65 (1H,t,J=9.7 Hz,H-7)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物5为psiguadial D。

化合物6无色油状物(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:4.17 (1H,s,2-OH),2.61 (2H,t,J=6.6 Hz,H2-8),2.16 (3H,s,H3-2′),2.11 (6H,s,H3-1′,H3-3′),1.23 (3H,s,H3-4′),0.87 (6H,d,J=6.5 Hz,H3-13′′,H3-16′′),0.85 (3H,d,J=6.5 Hz,H3-14′′),0.84 (3H,d,J=6.5 Hz,H3-15′′);13C NMR (CDCl3,100 MHz)δ:145.5 (s,C-4a),144.5 (s,C-2),122.6 (s,C-4),121.0 (s,C-3),118.4 (s,C-1),117.3 (s,C-8a),74.5 (d,C-6),39.8 (s,C-1′′),39.4 (s,C-11′′),37.4,37.4,37.4,37.3 (d,C-3′′,C-5′′,C-7′′,C-9′′),32.8 (s,C-8′′),32.7 (s,C-4′′),31.5 (s,C-7),28.0 (d,C-12′′),24.8 (s,C-6′′),24.4 (s,C-10′′),23.8 (d,C-4′),22.7 (d,C-16′′),22.6 (s,C-13′′),21.0 (d,C-2′′),20.7 (s,C-8),19.74,19.65 (s,C-14′′,C-15′′),12.2 (s,C-2′),11.8 (s,C-1′),11,3 (s,C-3′)。以上数据与文献[16]对照基本一致，故确定化合物6为α-生育酚。

化合物7无色油状物(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.28～5.43 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),2.77～2.83 (2H,m,H2-11),2.35 (2H,t,J=7.3 Hz,H2-2),2.00～2.11 (4H,m,H2-8,H2-14),1.63 (2H,t,J=6.0 Hz,H2-3),1.20～1.40 (14H,m,7×CH2),0.87 (3H,t,J=6.0 Hz,H3-18)。以上数据与文献[17]对照基本一致，故确定化合物7为亚油酸。

化合物9黄色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.73 (1H,brs,H-2′),7.57 (1H,brd,J=8.0 Hz,H-6′),6.86 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.39 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.15 (1H,d,J=7.0 Hz,H-1′′),3.89 (1H,t,J=7.3 Hz,H-2′′),3.82 (1H,m,H-5′′a),3.80 (1H,m,H-4′′),3.63 (1H,brd,J=7.4 Hz,H-3′′),3.43 (1H,brd,J=11.1 Hz,H-5′′b)。以上数据与文献[18]对照基本一致，故确定化合物9为槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物10黄色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.52 (1H,brs,H-2′),7.48 (1H,brd,J=8.2 Hz,H-6′),6.89 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.38 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.46 (1H,s,H-1′′),4.32 (1H,s,H-1′′),3.44～4.37 (5H,m,H-1′′-H-5′′)。以上数据与文献[19]对照基本一致，故确定化合物10为槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

化合物11无色针晶(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.33 (1H,m,H-6),3.50 (1H,m,H-3),0.99 (3H,s,H3-19),0.91 (3H,d,J=6.2 Hz,H3-21),0.79～0.86 (9H,m,H3-26,H3-27,H3-29),0.66 (3H,s,H3-18)。以上数据与文献[20]对照基本一致，故确定化合物11为β-谷甾醇。

化合物12白色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.83 (1H,brs,H-2′),6.75 (1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),6.71 (1H,brd,J=8.8 Hz,H-6′),5.92 (1H,brs,H-8),5.84 (1H,brs,H-6),4.55 (1H,d,J=7.4 Hz,H-2),3.96 (1H,m,H-3),2.84 (1H,m,H-4α),2.49 (1H,m,H-4β)。以上数据与文献[21]对照基本一致，故确定化合物12为儿茶素。

化合物13白色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.05 (2H,s,H-2,H-6)。以上数据与文献[22]对照基本一致，TLC检测结果与对照品没食子酸一致，故确定化合物13为没食子酸。

4 抗癌活性测定

采用MTS法[10]评价化合物5对人体肿瘤细胞株HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的体外活性。用含10%胎牛血清培养液(DMEM或RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔5 000～10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，贴壁细胞提前12 h接种培养。加入待测化合物溶液(固定浓度40 μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200 μL，每种处理均设3个复孔。37 ℃培养48 h后，吸弃孔内培养上清液，每孔加MTS溶液20 μL以及培养液100 μL。继续孵育1～4 h，使反应充分进行。选择490 nm波长，酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值，结果见表1。

表1 化合物5的细胞毒活性(IC50,μM)Table 1 Cytotoxicity data of compound 5 (IC50,μM)

由表1可以看出，化合物5对所有人体肿瘤细胞株均显示出较为明显的抑制活性，对SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的抑制活性均优于阳性对照药物顺铂(cisplatin)。

5 结论

含有3,5-二甲酰基苄基间苯三酚特征结构单元的混源杂萜是从桃金娘科植物番石榴叶中发现的一类罕见结构，这种特征结构单元能够与萜烯、黄酮杂合形成多种抗肿瘤活性显著的新奇骨架。从天然产物化学研究角度出发，番石榴杂萜类次生代谢产物是一类不可多得、具有极高“创造系数”和显著生物活性，值得深入研究的宝贵资源。本课题组前期已从越南产番石榴叶中分离得到5个具有抗肿瘤活性的杂萜类化合物guajadials B-F[9,10]，并在提出合理生源假说的基础上，通过“萜烯-二甲酰基间苯三酚-苯甲醛”三分子偶联反应，完成了对guajadial B的仿生合成[9]。为进一步研究番石榴的药用物质基础，本文对我国云南产番石榴叶的化学成分进行了系统分离，得到了13个化合物，包括5个该植物中特有的杂萜成分1～5。其中，化合物1为Lee等[15]在合成番石榴杂萜guajadial 和psidial A时得到的异构化副产物，为首次从天然产物中分离得到；化合物5对5种人体肿瘤细胞株显示出较为明显的抑制活性，且对SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的抑制活性均优于阳性对照药物顺铂(cisplatin)。以上研究结果为番石榴叶在抗肿瘤方面的应用提供了科学依据。