黄芩苷PEG-PE纳米胶束的制备、表征与细胞毒性研究Δ

宁国庆，吴洁，葛晨亮，周定荣，唐义信#（.南华大学附属第一医院心内科，湖南衡阳400；.中南大学湘雅二医院中心实验室，长沙 400）

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是 内科常见的急症，为冠心病中最凶险的一种[1]。心肌梗死早期及时恢复冠脉血流是挽救AMI患者的根本措施，但随之诱发的心肌缺血再灌注（Ischemia reperfusion，IR）损伤，可能会进一步扩大心肌梗死面积。目前研究证实，心肌IR损伤机制主要表现为线粒体功能紊乱，从而引发心肌细胞出现大量凋亡和自噬[2-3]，因此，恢复线粒体的正常功能对于减轻心肌IR损伤具有重大临床研究价值。目前，治疗AMI的药物很难滞留在缺血心肌部位，加之细胞膜屏障的阻碍，细胞摄取量少，到达线粒体效应靶点的药物量微乎其微，故需采用大剂量给药，但大剂量药物又可能诱发非靶向部位的药物蓄积，导致不良反应的发生。因此构建一种新型载药系统，增加药物在心肌细胞内的摄取量，尽量将药物传递到线粒体，对于减少心肌细胞凋亡具有非常重要的科学研究价值。

黄芩苷（Baicalin，BAI）是从中药黄芩（Scutellaria baicalensisGeorigi）的干燥根中提取的一种黄酮类成分，在心脑血管方面具有改善心肌IR损伤、改善脑组织损伤和抗心律失常等多种作用[4]。Wang XB等[5]研究发现，BAI预处理能够抑制线粒体损伤介导的凋亡，减少心肌IR损伤。但BAI存在亲水性和亲油性均较差、体内半衰期短等成药性问题[6-7]。聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺（Polyethylene glycol-derivatized phosphatidylethanolamine，PEG-PE）是体内可降解并经美国FDA批准的可用于人体的药物载体材料，常用于增加难溶性药物的溶解度和提高药物在体内的靶向分布。有研究报道，PEG-PE纳米胶束在缺血心肌部位具有很好的渗透与滞留（Enhanced permeability and retention time，EPR）效应，能将药物蓄积于缺血心肌部位，具有良好的心脏靶向性；PEG-PE纳米胶束还可以促进药物的跨膜转运，有助于将药物递送到亚细胞器效应部位[8-9]。因此，笔者以PEG-PE纳米胶束为载体，制备了BAI@PEG-PE纳米胶束，并对其进行表征和细胞毒性研究，以期为AMI的治疗提供新的选择药物。

1 材料

1.1 仪器

Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪（英国马尔文公司）；Agilent 1200高效液相色谱（HPLC）仪（美国安捷伦公司）；Eyelan-1001旋转蒸发仪（亚宏科技有限公司）；VL2000DX-SVF17SP激光扫描共聚焦显微镜（日本Lasertech公司）；BT25S电子分析天平（南京莱步科技实业有限公司）；TGL-16M台式离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；JEM-2100透射电镜（日本电子株式会社）。

1.2 药品与试剂

BAI原料药（成都锐可生物科技有限公司，批号：180522，纯度：≥98%）；BAI对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110715-201117，供含量测定用，纯度：≥98%）；PEG-PE（上海芃圣生物科技有限公司，批号：20190216）；香豆素6（C6，百灵威科技有限公司，批号：72609-201714，纯度：≥98%）；氯化硝基四氮唑蓝（NBT，上海如吉生物科技有限公司）；线粒体红色荧光探针（MitoTrackerTMRed）、细胞核染料Hoechst 33342均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）小鼠源单克隆抗体和二抗（艾美捷科有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（苏州宇恒生物科技有限公司）；异丙肾上腺素（ISO，上海伊卡生物技术有限公司）；甲醇（美国Thermo Fisher试剂公司，色谱纯）。

1.3 细胞

H9c2心肌细胞株购自南京科佰生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1BAI@PEG-PE纳米胶束的制备

精密称取BAI 10 mg、PEG-PE 40 mg置于旋蒸瓶中，加入甲醇约50 mL促使其完全溶解，通入氩气进行保护，调节转速为50～120 r/min，由快至慢，旋转蒸发形成一层均匀干燥薄膜，再将旋蒸瓶置于冰水浴中，抽真空干燥约10 h除去残留有机溶剂，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）约5 mL，促使薄膜水合，再于40℃水浴下水化60 min，再超声（频率：40 Hz，功率：120 W）10 min，室温下放置1 h，经0.22 μm微孔滤膜过滤4～5次除去沉淀物，再真空冷冻干燥24 h，制得BAI@PEG-PE纳米胶束冻干粉。

2.2BAI@PEG-PE纳米胶束的外观特征

称取适量BAI@PEG-PE纳米胶束冻干粉，加入蒸馏水，超声（频率：40 Hz，功率：120 W）5 min使粒子分散均匀，取少量滴加在200目铜网上，再用滤纸吸走多余的液体，室温烘干，使用透射电镜观察BAI@PEG-PE纳米胶束的外观特征。BAI@PEG-PE纳米胶束的透射电镜图见图1。

图1BAI@PEG-PE纳米胶束的透射电镜图Fig 1 TEM of BAI@PEG-PE nanomicelles

由图1显示，BAI@PEG-PE纳米胶束呈现大小比较均一的圆球形。

2.3BAI@PEG-PE纳米胶束的表征

称取适量BAI@PEG-PE纳米胶束冻干粉，加入蒸馏水，超声（频率：40 Hz，功率：120 W）5 min使粒子分散均匀，使用Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪检测胶束的粒径分布、多分散系数（PDI）和Zeta电位。结果显示，BAI@PEG-PE纳米胶束的粒径为（16.7±0.8）nm，PDI为 0.11±0.01，Zeta电位为（－18.4±0.6）mV（n＝3），粒径分布图见图2，Zeta电位分布图见图3。

比较图1和图2结果发现，图2中BAI@PEG-PE纳米胶束的粒径明显大于图1显示的结果，这可能与Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪检测的是水合粒径有关。

2.4BAI@PEG-PE纳米胶束的包封率与载药量

图2BAI@PEG-PE纳米胶束的粒径分布图Fig 2 Distribution of particle size of BAI@PEG-PE nanomicelles

图3 BAI@PEG-PE纳米胶束的Zeta电位分布图Fig 3 Distribution of Zeta-potential of BAI@PEG-PEnanomicelles

2.4.1 BAI的含量测定 参照2015年版《中国药典》（一部）黄芩下BAI的含量测定方法[10]，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）为流动相，检测波长为280 nm，进样量为10 μL，理论板数按BAI峰计应不低于2 500。方法验证结果显示，BAI检测质量浓度的线性范围为20～80 μg/mL（r＝0.999 9），精密度、稳定性试验中峰面积的RSD＜1%（n＝3），平均加样回收率为99.8%（n＝3），该方法符合相关标准。

2.4.2 包封率与载药量 取BAI@PEG-PE纳米胶束溶液500 μL，置于超滤离心管中，低温下10 000 r/min离心5 min，取离心管内的BAI@PEG-PE纳米胶束溶液，冷冻干燥后称质量，记为m总，然后加入10倍体积量的甲醇破坏纳米胶束结构，检测其中BAI质量，记为m0；离心管外为游离BAI，测定游离BAI质量，记为m1，计算BAI@PEG-PE纳米胶束的包封率（EE，%）和载药量（DL，%）。EE＝m0/（m1+m0）×100%，DL＝m0/m总×100%。结果显示，BAI@PEG-PE纳米胶束的包封率为（85.7±4.9）%、载药量为（7.84±0.65）%（n＝3）。

2.5BAI@PEG-PE纳米胶束的稳定性

将BAI@PEG-PE纳米胶束置于4℃的冰箱中放置2个月后检测该胶束的粒径、Zeta电位、载药量和包封率。结果显示，放置2个月后BAI@PEG-PE纳米胶束的粒径为（17.4±1.6）nm、Zeta电位为（－20.4±0.7）mV、载药量为（8.06±0.37）%、包封率为（83.7±5.4）%，与放置前初始结果相差不大，故BAI@PEG-PE纳米胶束在4℃下放置2个月的稳定性良好。

2.6BAI@PEG-PE纳米胶束的体外释放

将BAI原料药（100 μg）和BAI@PEG-PE纳米胶束（含100 μg BAI）装入透析袋（截留分子量为3 000）中，两端采用夹子封闭，置于200 mL pH 7.4的PBS中，设定水温为37 ℃。分别于1、3、6、9、12、16、20、24、36、48、60、72、84 h取样，取样体积为300 μL，取样同时补充等温等量的pH 7.4的PBS。参照2015年版《中国药典》（一部）黄芩下BAI的含量测定方法[10]检测各时间点取样液中的BAI含量，计算BAI@PEG-PE纳米胶束的累积释放度（Q），绘制体外释放曲线。BAI原料药和BAI@PEG-PE纳米胶束的体外释放曲线见图4。

图4BAI原料药和BAI@PEG-PE纳米胶束的体外释放曲线Fig 4 Release curve in vitro of BAI raw material and BAI@PEG-PE nanomicelles

由图4可知，BAI在24 h内已经释放达到92.1%，基本上释放完全，而BAI@PEG-PE纳米胶束有明显的缓释作用，84 h的累积释放度仅为76.5%。

2.7 H9c2心肌细胞摄取

考虑到BAI自身无荧光，故采用带绿色荧光的C6为荧光探针，按BAI@PEG-PE纳米胶束的制备方法，采用薄膜水化法，将C6包埋于PEG-PE纳米胶束亲脂性内核中，即可获得带绿色荧光的C6@PEG-PE纳米胶束。将H9c2心肌细胞接种到12孔培养板中，细胞密度为1.0×105个/孔，培养24 h。然后将C6@PEG-PE纳米胶束或者C6分别与H9c2心肌细胞共同孵育，C6的质量浓度为100 ng/mL，孵育4 h后，采用线粒体红色荧光探针染色，最后采用少量pH 7.4的PBS洗涤细胞数次，尽量清除细胞外残留的荧光物质，最后采用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光物质在细胞内的分布情况。激光扫描共聚焦图见图5。

由图5显示，C6有少量进入H9c2心肌细胞内，并与线粒体重合，显示黄色，与文献[11-12] 报道一致，其可能的原因是亲脂性C6在亲水性细胞液中跨膜转运相对困难，因此摄取进入细胞内的量相对较少。与C6比较，C6@PEG-PE纳米胶束进入H9c2心肌细胞内的量明显较多，且大量与红色的线粒体部位重合。由此可见，PEG-PE纳米胶束不仅能显著增强C6的水溶性，还可能诱导H9c2心肌细胞形成临时性的孔道，便于C6跨膜转运进入细胞。提示PEG-PE纳米胶束能显著增加药物的H9c2心肌细胞摄取量，并使药物聚集在线粒体部位。

2.8 体外细胞凋亡试验

图5 激光扫描共聚焦图（×500）Fig 5Laser scanning confocal map（×500）

2.8.1 细胞处理与分组 将H9c2心肌细胞接种到12孔培养板中，细胞密度为1.0×105个/孔，培养24 h后随机分为模型组、BAI原料药组和BAI@PEG-PE纳米胶束组。模型组参照文献报道方法[13-14]，以无血清DMEM培养液加入ISO 10 μmol/L与H9c2心肌细胞共同孵育24 h复制心肌细胞凋亡模型；BAI原料药组细胞先在培养基中加入30 μmol/L BAI原料药预处理0.5 h，再加入ISO 10 μmol/L共同孵育24 h；BAI@PEG-PE纳米胶束组细胞先在培养基中加入30 μmol/L BAI@PEG-PE纳米胶束预处理0.5 h，再加入ISO 10 μmol/L作用24 h。

2.8.2 Hoechst染色观察凋亡细胞数量 取H9c2心肌细胞，按“2.7.1”项下方法分组培养后，用4%甲醛溶液固定，再以PBS洗涤数次，用DAPI对细胞核进行染色，再采用荧光显微镜观察细胞核的形态变化，统计凋亡率。各组细胞Hoechst染色图见图6（图中 所指为蓝色光斑），细胞凋亡率的测定结果见图7。

由图6和图7显示，模型组细胞出现了明显的暗淡、皱缩，碎裂的且呈明亮蓝色的细胞为凋亡细胞。BAI原料药组和BAI@PEG-PE纳米胶束组的凋亡细胞显著少于模型组（P＜0.01），其中BAI@PEG-PE纳米胶束组的凋亡细胞最少（P＜0.01）。表明BAI@PEG-PE纳米胶束的抗心肌细胞凋亡效果作用优于BAI原料药。

图6 各组细胞Hoechst染色图（×300）Fig 6Hoechst staining of cell in each group（×300）

图7 各组细胞凋亡率的测定结果Fig 7 Apoptosis rate of cell in each group

2.8.3 Western blot法检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达 采用Western blot法检测细胞中凋亡相关Bax、Bcl-2蛋白的表达。取H9c2心肌细胞，按“2.7.1”项下方法分组培养后，提取总蛋白，定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，封闭，加入兔抗鼠Bcl-2（稀释比例：1∶1 000）、Bax（稀释比例：1∶1 000）单克隆抗体孵育后，用TBST缓冲液清洗，再加入二抗进行孵育，次日TBST缓冲液洗膜，用增强化学发光（ECL）检测液显影定影后，用Image J软件进行灰度分析。以目标蛋白与内参GAPDH的比值进行评价，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。各组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的电泳图见图8，蛋白表达测定结果见图9。

由图8和图9显示，与模型组比较，BAI原料药组和BAI@PEG-PE纳米胶束组细胞中Bcl-2蛋白表达明显增强，Bax蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中BAI@PEG-PE纳米胶束组的上述效果强于BAI原料药组（P＜0.05）。

3 讨论

图8 各组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的电泳图Fig 8 Electrophoretogram of protein expression of Bcl-2 and Bax of cell in each group

图9 各组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的测定结果Fig 9 Protein expression of Bcl-2 and Bax of cell in each group

PEG-PE的外壳PEG具有良好的水溶性、生物相容性和无免疫原性，可以减弱体内免疫系统如肝脾网状内皮系统的特异性识别功能，加之其大分子尺寸结构，不易被肾小球滤过，故在体内可以长循环，从而延长药物的体内作用时间[15]。内核PE具有良好的亲脂性，BAI属于难溶于水的黄酮类成分，具有一定的疏水性，恰好可以融合在疏水性内核PE中。本研究以PEG-PE纳米胶束为载体材料，将难溶性BAI包埋在胶束内核中，表征结果显示BAI@PEG-PE纳米胶束具有粒径小、包封率及载药量高等优良特点。体外释放结果表明，BAI@PEGPE纳米胶束在初期24 h释放较快，突释主要是由于胶束表面吸附或不完全包埋药物迅速释放的结果，24 h后释药比较相对缓慢，缓释是由于药物被PEG-PE纳米胶束包埋于内核中，与亲脂性内核PE完全融合在一起，较难解离释放，这样一来可以减少药物在体内循环过程中的损失，从而将更多的药物输送到有效部位。

本试验以具有绿色荧光的C6为探针，制备成C6@PEG-PE纳米胶束，与C6相比，结果显示H9c2心肌细胞摄取C6@PEG-PE纳米胶束的量显著增加，且进入细胞后还能富集在心肌细胞线粒体周围，这样有助于药物在该细胞器部位发挥疗效。心肌细胞凋亡试验结果显示，BAI@PEG-PE纳米胶束可以明显降低细胞凋亡率，还能显著抑制促凋亡蛋白Bax的表达，提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达，进一步可以推测PEG-PE纳米胶束可以增加BAI在细胞内的摄取量，还能有助于递送BAI至线粒体部位，故抗心肌细胞凋亡作用显著强于BAI原料药。

综上所述，BAI@PEG-PE纳米胶束具有粒径小、高包封率、缓慢释药等优势，还能促进BAI的心肌细胞摄取，并聚集在线粒体部位，显著提高药物的抗心肌细胞凋亡作用。