高效液相色谱法测定蜂胶中的六种黄酮

霍丽斯 ， 刘嘉亮 ，陈颖芯

（1.华南理工大学，广东广州 510000；2.广东产品质量监督检验研究院，广东广州 510000；3.广东药科大学，广东广州 510000）

蜂胶，又被称为“紫色黄金”，是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，混入蜜蜂口器中腺体的分泌物，再和花粉、蜂蜡加工制成的一种胶状物质，是蜂巢的保护伞[1]。蜂胶具有多种生物学功能，其中发挥重要作用的生物活性物质就是黄酮类物质[2]。主要研究的6种黄酮化合物分别为芦丁、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素。黄酮化合物作为蜂胶的主要功效成分，也使得蜂胶具有较强的天然抗氧化性能、抑菌活性、抗病毒和抗癌等多种生物学功能和药理学作用，能够增强机体免疫并治疗多种疾病[3-4]。黄酮类化合物的含量也因此常被作为评价蜂胶质量的指标之一[5]。因此，寻求一种高效、快速、准确的检测蜂胶中黄酮类物质的测定方法有着重要的意义。目前，黄酮类化合物含量的测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、纸色谱PC和薄层色谱TLC法、荧光测定法、原子吸收光谱法、近红外漫反射光谱法、共振散射光谱法、薄层扫描法和单扫示波极谱法等，其中最常用的就是紫外分光光度法和高效液相色谱法，其他方法使用频率不高[6]。试验研究不同体积比甲醇-水溶液对蜂胶中6种黄酮的提取效果，通过对空白样品加标，借助高效液相色谱法-紫外检测器测定回收率，以寻找合适提取液的浓度。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290型超高效液相色谱仪；PL203型分析天平，梅特勒-托利多公司产品；JP-C600超声波水浴仪，广州市吉普超声波电子设备有限公司产品；涡旋混合器；移液枪 （20～200，100～1 000 μL）。

芦丁、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标品（99.0%），德国SIGMA公司提供；甲醇、乙腈，均为色谱纯；磷酸，分析纯；二级水。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

将芦丁、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准品用甲醇配制成100 μg/mL混合标准溶液，再用甲醇∶水（1∶1） 依次稀释配成0.2，1.0，5.0，10，20，50 μg/mL 6个不同质量浓度的标准工作溶液于进样瓶中，在涡旋混合器上充分涡旋混匀，待测。

1.2.2 样品的前处理

称取0.1 g（精确到0.000 1 g） 混合均匀的蜂胶样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入25 mL甲醇溶液，充分摇匀并在涡旋混合器上涡旋混合20 s，于超声波水浴中超声处理20 min，取出加入15 mL纯水，充分摇匀，于超声波水浴中再超声处理20 min，取出冷却至室温，将试样溶液转移至100 mL容量瓶中，用甲醇少量多次洗涤聚丙烯离心管并在涡旋混合器上充分涡旋，将洗涤液一并转移到100 mL容量瓶内，最后用60%的甲醇+水定容至刻度。充分摇匀后，用注射过滤器将试样溶液通过有机系滤膜过滤至进样瓶中，在涡旋混合器充分涡旋后，供超高效液相色谱仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Aglient5 TC-C18（2）型，250 mm×4.6 mm；进样量20 μL，柱温40℃，流速0.80 mL/min，检测波长：莰菲醇、芹菜素、苛因、高良姜素270 nm；芦丁255 nm，松属素225 nm；流动相A：甲醇，流动相B：二级纯水（用磷酸调节pH值3）。色谱分离梯度条件如下：T=0.00 min时，A为40%，B为60%；T=10.0 min时，A为40%，B为60%；T=13.0 min时，A为55%，B为45%；T=25.0 min时，A为70%，B为30%；T=31.0min时，A为40%，B为60%；T=35.0 min时，A为40%，B为60%，流量均为0.800 mL/min。

2 结果与分析

2.1 方法的线性和检出限

为了提高方法的可靠性和结果的准确度，采用标准加入法，以样品含量为本底，分别加入各物质本底含量的0，1，2，5，10倍的标准品，按照1.2.2的前处理方法进行处理，在1.2.3的色谱条件下进行定性定量测定。结果表明，芦丁、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素均在0.2～50.0 μg/mL质量浓度范围内呈良好线性关系，相关系数（R2）均大于0.999。采用加标方式考查方法检出限，以S/N≥3作为方法检出限，得到芦丁、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素检出限均为0.1 g/kg。

线性和检出限见图1，蜂胶样品测定见表1。

图1 线性和检出限

表1 蜂胶样品测定

2.2 精密度

按照1.2的样品前处理方法称取6份混合均匀的蜂胶样品，加标含量为样品本底含量的1倍，进行6次平行测定试验，测定结果表明该方法精密度良好。

蜂胶精密度试验结果见表2。

表2 蜂胶精密度试验结果

2.3 回收试验

试验选取蜂胶作为样品和6种不同体积分数甲醇溶液（0，10%，20%，40%，60%，80%，100%甲醇）作为提取液；加标量是本底的1，2，5，10倍（蜂胶本底芦丁为20 mg/g，莰菲醇为0.8 mg/g，芹菜素为0.3 mg/g，松属素为3.0 mg/g，苛因为2.0 mg/g，高良姜素为4.0 mg/g）每个质量浓度做5个平行，按照 1.2的方法处理样品，最后供超高效液相色谱仪测定。每个质量浓度的回收率结果以平均值表示。

5倍本底加标量6种黄酮物质的回收率见图2。

图2 5倍本底加标量6种黄酮物质的回收率

3 结论

由试验结果可看出，以60%的甲醇-水提取蜂胶中6种黄酮物质取得较好的提取效率，以甲醇和水（用磷酸调节pH值3）为流动相进行梯度洗脱取得较好的分离效果，回收率均达到85%以上，满足实验室测定要求。该方法准确可靠、稳定性高、操作简便，可满足对于不同蜂胶制品中6种黄酮含量的判断，具有现实意义。