黑芸豆肽饮料的研制
2019-06-25孙先保徐尚英何述栋
杨 旭，李 菁，孙先保，杨 柳，徐尚英，何述栋
（1.安徽新希望白帝乳业有限公司，安徽合肥 231600；2.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥 230009；3.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230009；4.安徽海神黄酒集团有限公司，安徽合肥 231561）
国际粮农组织的统计表明，芸豆作为一种食用豆类作物，种植面积仅略低于大豆，位居第2位，广泛分布于我国东北、华北、西北和西南等地区[1-3]。芸豆的品种较多，根据颜色可分为白芸豆、红芸豆、紫花芸豆、黑芸豆等。同时，芸豆的营养也较为丰富，蛋白质含量约为23.1%，脂肪1.3%，碳水化合物56.9%，含钙76 mg/100 g，以及丰富的B族维生素[4-5]，是一种比较难得的高钾、高镁、低钠食品，氨基酸比例比较均衡[6]，可作为粮豆配合开发新营养主食品种的原料，也是杂粮酿酒制酱的主要来源。近年来的蛋白质功能性研究表明，白芸豆蛋白质中含有一种天然的α-淀粉酶抑制剂[7-8]，可以用来治疗肥胖症和糖尿病等[9]，并含有受到医学界广泛重视的花色苷、皂苷等有效成分，不仅可以提高人体免疫力、增强人体抗病能力，还对肿瘤细胞增殖有抑制作用[10]。
与大分子蛋白相比，多肽具有可直接被机体吸收、消化利用率高、低免疫原性、促进代谢的特点[11-13]，不论在营养供给还是疾病治疗方面都具有不可替代的作用[14]。然而，到目前为止，芸豆蛋白的开发利用率还较低。以黑芸豆蛋白为原料，采用酶解工艺制备黑芸豆肽，并利用最佳水解条件下的产物研制具有抗氧化活性的黑芸豆肽饮料，以期为芸豆蛋白产业的综合开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器
小黑芸豆，黑龙江黑土小镇现代农业开发有限公司提供；柠檬酸（食品级）、白砂糖；风味蛋白酶（15 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司提供；DPPH、无水乙醇、甲醛、氢氧化钠，均为分析纯。
PHS-3C型精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；752型紫外分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司产品；HH-4型数显水浴锅，常州国华电器有限公司产品；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品。
1.2 试验方法
1.2.1 黑芸豆肽的制备
选择颗粒饱满、无虫害的黑芸豆进行清洗，浸泡过夜，按料液比1∶8磨浆，过滤浆液，使其通过120目筛，分别收集豆浆和粗渣。将粗渣进行二次磨浆、分离，最后去除豆渣。将经上述处理后的黑芸豆蛋白溶液水浴加热至所需的温度，调节pH值至设定值，加入相应量的蛋白酶低速搅拌酶解。酶解时间结束后，立即置于沸水浴中灭酶10 min，冷却得到黑芸豆肽溶液。
1.2.2 黑芸豆肽饮料的制备
将上一步获得的黑芸豆肽溶液作为主要原料，加入适量的白砂糖、柠檬酸调味，进行均质处理，均质温度为60～65℃，均质压力为14.7 MPa，之后在121℃下杀菌15 min获得终产品。
1.2.3 响应面试验设计
根据Box-Beknhen中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，以酶添加量、酶解温度、酶解时间为特征值（Xi），分别以酶解度和抗氧化性为响应值（Yi），设计三因素三水平响应面试验，共17个试验点，其中12个分析点、5个零点，零点试验5次，以估计误差。
响应面试验设计因素及水平见表1。
表1 响应面试验设计因素及水平
1.2.4 正交试验设计
根据前期的单因素试验结果，对黑芸豆肽添加量（W/W，%）、加糖量（W/W，%）、柠檬酸添加量（W/W，%）进行参数优化，设计L9（34）正交试验。
黑芸豆肽饮料配方优化正交试验因素水平见表2。
1.3 评价方法
表2 黑芸豆肽饮料配方优化正交试验因素水平/%
1.3.1酶解度的测定——甲醛滴定法
用0.02 mol/L标准NaOH溶液滴定至溶液显微红色，计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。计算公式如下：
式中：Vsample——待测液消耗标准NaOH溶液的体积；
Vcontrol——对照液消耗标准NaOH溶液的体积；
nNaOH——标准NaOH溶液的摩尔浓度。
1.3.2 抗氧化性的测定
用无水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。配置0.5 mg/mL的维C溶液（作为对照组）。将测试样品稀释至不同浓度。将2 mL测试样品溶液及2 mL DPPH溶液加入到同一试管中，摇匀，于室温下暗处静置30 min后测定其吸光度Asample，同时测定2 mL DPPH溶液与2 mL溶剂混合后的吸光度Acontrol，以及2 mL测试样品溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度Ablank。自由基清除能力的表示如下：
1.3.3 感官评价
选择并培训10名感官评定人员，在室温下按参照GB 19302—2010制定的感官评分标准表。
黑芸豆饮料感官品质评分见表3。
表3 黑芸豆饮料感官品质评分
1.4 统计分析
所有试验均平行测定至少3次，采用Design Expert 8.0.5.0软件进行响应面结果分析，通过Excel 2016软件制图。
2 结果与分析
2.1 黑芸豆肽酶解条件的响应面分析
响应面试验结果见表4。
表4 响应面试验结果
使用Design Expert V 8.0.5.0软件，对表4中数据进行回归拟合，分别得到各响应值（Yi）对X1，X2，X3的回归方程：
对以上回归方程进行方差分析。
黑芸豆酶解产物的酶解度回归方程方差分析见表5。
表5 黑芸豆酶解产物的酶解度回归方程方差分析
由表5可知，黑芸豆酶解产物的酶解度的模型回归项极显著 （p＜0.01），失拟项不显著 （p＞0.05），说明方程拟合接近实际。回归方程的相关系数R2=0.986 4，adjR2=0.968 9，说明试验误差小，模型各项均达到理想水平，可以较好地反映因素与响应值之间 的 关 系 。 方 程 中 X2， X3， X1X3， X2X3，，均为较显著 （p＜0.05），X1，X1X2不显著 （p＞0.05），说明试验因子与响应值不是简单的线性关系。对回归方程进行中心标准化处理，根据回归系数绝对值的大小得到各因素对酶解度的贡献大小依次为X3（酶解时间） ＞X2（酶解温度） ＞X1（酶添加量）。
黑芸豆肽抗氧化性回归方程方差分析见表6。
表6 黑芸豆肽抗氧化性回归方程方差分析
由表6可知，黑芸豆肽抗氧化性的模型回归项极显著（p＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05），说明方程拟合接近实际。回归方程的相关系数R2=0.979 0，Adj R2=0.952 0，说明试验误差小，模型各项均达到理想水平，可以较好地反映因素与响应值之间的关系。方程中 X1，X2，X1X3，X2X3，均为较显著 （p＜0.05），X3，X1X2不显著 （p＞0.05），说明试验因子与响应值不是简单的线性关系。对回归方程进行中心标准化处理，根据回归系数绝对值的大小得到各因素对抗氧化性的贡献大小依次为X2（酶解温度） ＞X1（酶添加量） ＞X3（酶解时间）。
根据黑芸豆肽酶解度和抗氧化性的响应面回归方程做响应面图，固定其中1个因素，考查另2个因素的交互作用。通过分析拟合响应曲面的形状和等高线的疏密，分析各因素对该指标响应值的影响情况，并进一步确定黑芸豆酶解的最佳工艺条件。
黑芸豆蛋白酶解度响应面图见图1，黑芸豆肽抗氧化活性响应面图见图2。
由图1可见，随着加酶量的增加，酶解度逐渐增大，当加酶量达到4%时，酶解度的增大趋于平缓；随着酶解时间的延长，酶解度先增大后减小，当酶解时间为180 min时达到最大；随着酶解温度的增加，酶解度缓慢增大但不显著，当酶解温度达到50℃时，趋于最大值。由图2可见，随着酶添加量的增加，抗氧化性先增大后减小，当酶添加量为4%时，抗氧化性最好；随着酶解时间的增加，抗氧化性缓缓增大，但斜率很小，当酶解时间为180 min时抗氧化活性的增长趋于停滞；随着酶解温度的提高，抗氧化性先增大后减小，当酶解温度为50℃时，达到最大值。这说明黑芸豆蛋白溶液的酶解度越高，其蛋白肽对DPPH自由基的清除能力越好，这与任海伟等人[15]的研究结果相一致。
综合考虑各因素，最后确定酶添加量4%，酶解温度50℃，酶解时间180 min为黑芸豆肽酶解的最佳条件。
图1 黑芸豆蛋白水解度响应面图
图2 黑芸豆肽抗氧化活性响应面图
2.2 黑芸豆肽饮料配方的正交结果分析
根据前期的单因素试验结果，确定黑芸豆肽添加量60%，白砂糖添加量13%，柠檬酸添加量0.03%为较优点，并在其附近取点进行正交试验。
正交试验结果见表7。
由表7可知，黑芸豆肽、白砂糖、柠檬酸的添加量对黑芸豆肽饮料的口感品质均有不同程度的影响，其中黑芸豆肽添加量是影响饮料品质的显著因子，各因素对黑芸豆肽饮料口感品质影响的主次顺序为A＞B＞C。最佳的配料比工艺参数为A2B3C2，即黑芸豆肽添加量为60%，白砂糖添加量为15%，柠檬酸添加量为0.03%，在此配料比下，研制的黑芸豆肽饮料的口感效果最佳。
对正交试验结果进行极差分析。
正交试验结果极差分析图结果图3。
表7 正交试验结果
图3 正交试验结果极差分析图
由图3可知，极差分析结果与正交试验表结果一致，各因素水平对因变量的影响较显著。
3 结论
在前期单因素试验的基础上对黑芸豆肽制备的酶解工艺进行了相应面优化，对黑芸豆肽饮料的配方进行了正交优化。分别得到了酶解度和抗氧化性的响应面模型方程，回归方差分析表显示黑芸豆酶解产物的水解度的模型、抗氧化性模型的回归项均极显著（p＜0.01），失拟项均不显著（p＞0.05），各因素对酶解度的贡献大小依次为X3（酶解时间）＞X2（酶解温度）＞X1（酶添加量），对抗氧化性的贡献大小依次为X2（酶解温度） ＞X1（酶添加量） ＞X3（酶解时间）。综合响应面图分析得黑芸豆肽制备的最佳酶解工艺为酶添加量4%，酶解温度50℃，酶解时间180 min。采用L9（34）正交试验表进行试验，黑芸豆肽饮料的正交优化结果表明，各因素对黑芸豆肽饮料口感品质影响的主次顺序为A＞B＞C。最佳的配料比工艺参数为A2B3C2，即黑芸豆肽添加量为60%，白砂糖添加量为15%，柠檬酸添加量为0.03%，在此配料比下研制的黑芸豆肽饮料的口感效果最佳。
