不同处理方式对槐米中芦丁稳定性的影响

刘修树, 付恩桃， 方丽波, 范高福, 何晓丽

(合肥职业技术学院 生物工程学院,安徽 合肥 238000)

芦丁，又名芸香苷、维生素P、路通等，存在于槐、连翘、枣和蒲公英等多种药用植物中[1-2]，现代药理研究显示芦丁有降低毛细血管通透性、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降脂等多种药理活性[3-4]，在医药、保健品、化妆品等方面有着广泛的应用[5-6]。但芦丁在化学结构上属于黄酮苷类，含有苷键和酚羟基[7-8]，容易受到植物中自身存在的酶、光[9]及空气中水分、氧气的影响而产生变质分解，失去原来的活性，含量降低，因此含有活性成分芦丁的中药材贮存方法的选择是保证其质量的一个非常重要的途径，目前国内对于这方面研究报道文献较少。本文针对上述影响芦丁稳定的因素，选择芦丁含量高、来源广的中药材槐米作为研究对象。槐米是来源于豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花蕾，具有凉血止血，清肝泻火之功效[10]，芦丁是其主要活性成分，2015版《中国药典》规定了槐米的贮藏条件：置于干燥处，防潮，并限定其含水量不得过11.0%，芦丁的含量不得少于15.0%。药典规定贮藏条件主要控制水分，而对其他因素没有明确的要求，因此对槐米的贮存方式的考察具有非常重要的实际意义。通过对新鲜槐米采用不同的方式处理后留存，达到杀灭酶的活性，避免光、空气等因素的影响来考察槐米中芦丁稳定性，从而优化槐米最佳的贮存方法，为临床合理使用槐米药材提供理论依据，同时也为类似性质中药贮存提供方法学借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验材料 新鲜槐米2014年购自于安徽普仁中药饮片有限公司。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号110726-200409)。

1.1.2 仪器设备 高效液相色谱仪：Agilent 1200高效液相色谱仪(包括：Agilent G1310A四元泵，Agilent G1322A 真空在线脱气机，Agilent G1314B-VWD紫外检测器，Agilent1200化学工作站);DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒)；P20000真空包装机(广州保士美)；电子天平(瑞士梅特勒)；BCD-301WBD电冰箱(合肥美菱)。

1.1.3 试剂 含量测定用甲醇为色谱纯(上海国药集团)，提取用甲醇为分析纯(天津光复精细化工有限公司)，变色硅胶(青岛裕宝精细化工有限公司)，水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 药材处理方法 一般贮存方法 新鲜的槐米药材置搪瓷托盘中，干燥箱60 ℃烘干，分10 g包装，在室温、干燥、避光的地方保存。

1.2.1.1 真空贮存方法 新鲜槐米药材置搪瓷托盘中，干燥箱60 ℃烘干，分10 g真空包装，两种方式贮存：一是在室温干燥地方，另一是在冰箱冷藏保存(置变色硅胶干燥剂)。

1.2.1.2 乙醇杀酶贮存方法 新鲜槐米药材置搪瓷托盘中，喷乙醇拌匀，焖润30 min，干燥箱60 ℃烘干，分10 g包装，冰箱冷藏保存(置变色硅胶干燥剂)。

1.2.1.3 蒸气杀酶贮存方法 蒸锅盘子上铺一层纱布，新鲜槐米均匀铺在纱布上，蒸气蒸3 min，干燥箱60 ℃烘干，分10 g包装，冰箱冷藏保存(置变色硅胶干燥剂)。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-1%冰醋酸(45∶55)；流速为1 mL/min；t=30 ℃；检测波长257 nm。理论板数按芦丁峰计算应不低于2 000。在此条件下样品中芦丁与其他相关峰均能良好的分离[11]。

1.2.3 待测样品溶液的制备 取槐米粗粉约0.1 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率25 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤。精密量取滤液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

图1 芦丁对照品色谱图

图2 槐米药材色谱图

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

精密称取105 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10.28 g，加流动相制成芦丁标准贮备液(1.208 mg/mL)。再分别配成5.14、10.28、20.56、25.70、51.40、102.8 μg/mL的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液20 μL，进样量为5 μL，经测定，分别得到对照品的峰面积为251 056、544 398、1 053 231、1 284 451、2 565 852、4 991 055，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度(μg/mL)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=48 348X+42 109；R=0.999 9。表明芦丁峰浓度在5.14～102.8 μg/mL之间呈良好的线性关系。

2.2 精密度试验

精密吸取中间25.70 μg/mL浓度的对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，分别为1 218 910、1 211 605、1 220 018、1 215 458、1 217 653、1 216 723、1 216 728，RSD为0.24%，测定结果表明仪器精密度良好。

2.3 重复性试验

取同一批号样品各6份，按上述方法测定。芦丁含量分别为22.41%、22.46%、22.37%、22.49%、22.33%、22.53%，平均值为22.43%，RSD为1.26%(n=6)，说明该法处理样品，重复性较好。

2.4 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，对主要色谱峰面积进行考察，RSD为0.39%，结果表明待测样品在24 h内稳定。

2.5 加样回收率试验

取上已测定含量的样品6份，每份约0.1 g，精密称定,置于6个10 mL的容量瓶中，加入芦丁对照液(0.124 g/L)各0.8、0.8、1.0、1.0、1.2、1.2 mL，按上述方法制备，进行测定。并计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率结果

2.6 待测样品溶液含量测定

按1.2.3节的方法制备样品溶液，在1.2.2节色谱条件分别按照0、6、12、24、36月测定不同处理方式样品中芦丁的含量，每个样品测定3次，取平均值，结果见表2。

表2 不同处理方式槐米中芦丁含量测定结果

从表2来看，在放置24个月及之前，槐米5种贮存方法芦丁含量均高于药典标准，放置36个月槐米一般贮存方法芦丁含量明显低于药典规定标准，真空室温法芦丁含量临界药典标准，其他3种贮存方法芦丁含量均高于药典标准，由此看出槐米在一般贮存条件下在2年内可以正常使用，真空低温和杀酶法在3年内正常使用。在真空低温和杀酶法3种方法中，杀酶法虽然稳定性较真空低温法略好，但增加了操作程序和必要的设备，从经济适用性考虑真空低温法是最合适的贮存方法。

3 结论与讨论

在两种杀酶法中，分别对乙醇的浓度，选择95%、90%、85%、80%，焖润时间，选择10、20、30、40 min，气蒸时间选择1、3、5、7 min进行了单因素考察。结果表明,乙醇浓度95%，焖润时间30 min，气蒸3 min较好，乙醇浓度越低，干燥时间延长；焖润或气蒸时间过短，杀酶效果不好，时间太长造成浪费，还可能影响槐米品质。

中药材和中药饮片往往含有大量的多糖类、蛋白质和脂肪等成分，容易受到自然环境中水分、温度、生物及空气等因素影响产生霉变、虫蛀或走油等变化影响其外观和质量。针对以上情况，《中国药典》对中药材和饮片贮存方法规定主要控制基本条件，如温度、水分及光等[12]，适用大多数药材。但是中药材和中药饮片活性成分含量一般较低，尤其一些含有苷类、酚类、醌类、挥发油等不稳定成分的中药材和中药饮片，更易受到内外因素影响，从而使有效成分含量降低，但有的在外观上没有明显的变化，这样可能从中药性状上导致误判是合格的进而在临床上继续使用，影响治疗效果。因此，不管是中药生产过程，还是经营和使用过程，除了药典规定贮存方法以外，还需要根据中药材和中药饮片的具体的活性成分稳定性主要影响因素进行研究，优化最佳的贮存方式。

由于当前国家对中药材和中药饮片还没有实行有效期管理[13]，在规定的贮存方法下无明确的使用期限，会使其缺少有效监管，可能在较长时间段一直使用，易导致有效成分含量达不到国家标准，不能在临床发挥应有的治疗作用，影响临床效果，最终对中医药的发展也会产生一定的负面影响。所以国家要首先针对一些有效成分稳定性差的中药材和中药饮片试行有效期管理，加强使用过程监管，探索科学合理的效期管理模式，这样既能保证中药材和中药饮片质量稳定性，也为后期的中药材和中药饮片普遍性进行效期管理提供经验。