肌酐检测方法学评价及其研究进展

谭红军 ，罗春华 ，杨林 ，董贞荣 ，张玉红 ，张新明 ，汪彬彬

1.湖北三峡职业技术学院医学院，湖北宜昌 443000；2.三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌 443003；3.湖北三峡职业技术学院附属医院，湖北宜昌 443000

肌酐 （Creatinine，Cr）是水溶性的有机含氮化合物，分子式为C4H7ON3，分子量为113.1188，又称2-氨基-1-甲基咪唑啉-4-酮，甲基胍基乙酸内酰胺。血中肌酐是肌肉组织中磷酸肌酸和肌酸通过非酶促、不可逆的脱磷酸反应生成的代谢终产物，少部分由肉类食物代谢产生，肌酐由肾脏排出。与尿素相比，肌酐从肾小球滤过后不被肾小管重吸收，受饮食因素影响也更小，因此血Cr和内生肌酐清除率Ccr更能准确反映肾小球滤过率（GFR）即肾脏的排泄功能。美国肾脏基金会肾脏病预后质量倡议（K/DOQI）专家组和我国均将GFR作为慢性肾脏病 （CKD）诊断与分期的依据，且均推荐根据血清Cr计算Ccr以评估GFR。全世界有超过5亿人患有不同程度的慢性肾脏病，发病率位居前10，我国CKD的发病率为10%～13%，所以准确检测Cr对CKD诊断与分期具有重要意义。Cr检测方法至今已报道过10余种，以下从肌酐检测方法学层面进行评述。

1 检测方法与评价

1.1 Jaffe反应

Jaffe反应法是检测肌酐的经典方法，1886年Jaffe发现在碱性环境中，肌酐和苦味酸反应生成橘红色的苦味酸肌酐（Janovski）复合物，在500～520 nm处检测，Greenwald经系统研究后认为是肌酐与苦味酸形成络合物所至。由于基质效应，血清存在不少的假肌酐，使检测结果偏高，如肌酐同系物乙内酰脲、及乙酰乙酸、葡萄糖、蛋白质、头孢菌类抗生素等；而胆红素、维生素C、血红蛋白等可使结果偏低。假肌酐属于非特异性范畴，胆红素、维生素C、血红蛋白则属于干扰，假肌酐约60%存在于红细胞中，约20%存在于血浆或血清，约5%存在于尿液，因此测定血液肌酐时最好用血清或血浆且不溶血。Nah等[1]证实胆红素负干扰Jaffe法当血Cr＜53 μmol/L时与胆红素浓度相关，Cr53～97.2 μmol/L时胆红素干扰显著，而酶法则显示无此干扰。Jaffe's法延用至今100多年，特异性不高以及干扰问题是其方法学的固有属性，为此Jaffe法经过了不断改良。

1.1.1 终点法从全血到血清，进行不去蛋白和去蛋白检测。利用钨酸溶液离心去蛋白终点法，回收率受无蛋白滤液pH影响，pH在3～4.5时为85%～90%，pH小于2时为100%，线性范围1320 umol/L。为减少非特异性反应，还采用过①利用白陶土、Fuller’s土、硅酸铝土或皂土吸附无蛋白滤液中的Cr，②利用阳离子交换树脂吸附无蛋白滤液中的Cr，再洗脱测定。这些方法样品处理繁琐，不适于自动仪器上进行批量样本测定。

1.1.2 二点（速率）法 根据肌酐、假肌酐与苦味酸形成络合物的速度不同，即快反应假肌酐物质如乙酰乙酸在20 s内完成反应，慢反应假肌酐物质（其它多数假肌酐）在80 s后才发生呈色反应，在此两个时间段内Cr与苦味酸显色反应占绝对优势，故选择20～80 s“窗口期”的反应速率来计算真肌酐的含量（不同于酶活性浓度速率法测定，肌酐的二点法是与校准液同步测定的）。回收率96.7%～100.4%，平均98.5%，线性范围1 768 μmol/L，CV5%。该方法成本低廉，操作简便，不需去蛋白等处理，适于自动分析，是血肌酐测定的常规方法，也是二点法在实际检验工作中的典型应用，在尿样重金属检测时的尿肌酐检测中也有重要价值[2]。

相关学者研究我国1 402家临床实验室肌酐检测系统的性能，室间质量评价EQA显示碱性苦味酸法CV为1.03%～18.23%，酶法CV为1.50%～8.08%，与酶法相比，可见Jaffe法虽经各种改良，但并没有从根本上改变非特异性反应的问题。

1.2 硫酸铜肌酐复合物氧化Metol光度法

相关研究者[3]于2017年进行硫酸铜肌酐复合物氧化Metol光度法分析，回收率101%～106%，日内CV2.5%～4.8%，日间 CV3.2%～7.8%，线性范围 4.4～620 μmol/L，与其他分光光度法相比，非特异反应与干扰可以忽略不计，结果不受样品基质影响，该固定时间法手工与自动分析均可。

此原理由Birdsall和Weber提出，硫酸铜与肌酐生成硫酸铜肌酐复合物，此复合物选择性氧化对-甲基氨基苯酚硫酸盐（Metol米吐尔）并被还原为硫酸亚铜肌酐复合物，导致形成亚胺基团并呈现深紫色，硫酸亚铜肌酐复合物的量与亚胺基团的生成量成正比，室温（27±5℃）30 min，在 530 nm 处定量检测。

1.3 酶法

酶法是基于肌酐经酶促反应而建立，目前报道有4条反应途径。

1.3.1 肌酐酰胺水解酶法 第一个酶法于1975年由Moss等报道，在肌酐酰胺水解酶（Creatinine amidohydrolase，EC3.5.2.10）也称肌酐酶（Creatininase)、肌酸激酶（CK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LDH）催化下，肌酐经肌酸、磷酸肌酸、丙酮酸生成乳酸，还需要还原型辅酶I、ATP和磷酸烯醇式丙酮酸参与反应，340 nm处动力学法检测，由标准曲线确定浓度。线性范围100 mg/L，回收率102%，1.0g/L的肝素、草酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、抗坏血酸盐或葡萄糖对测定没有显著影响；但30 g/L时对试验有抑制作用。该原理偶联四步反应使影响因素增加，内源性肌酸、肌酸磷酸、丙酮酸等会使结果偏高，以双试剂法消除之，即以肌酐酰胺水解酶构成试剂R2，其他成份组成试剂R1。该法曾被作为参考方法候选，但还原型辅酶I的高度不稳定和试剂高成本为临床实际应用带来障碍。

1.3.2 肌酐亚氨基水解酶-GLDH法1982年Tanganelli等报道了由肌酐亚氨基水解酶（creatinine iminohydrolase，EC3.5.4.21）催化肌酐生成N-甲基乙内酰脲和铵根，产物铵根再参与形成谷氨酸，20～37℃，15 min到达终点，340 nm处吸光度降低速率标准对照求得肌酐含量。反应的另一个工具酶是谷氨酸脱氢酶（GLDH，EC1.4.1.3），需 α-酮戊二酸及还原型辅酶Ⅱ，主要影响为内源性氨的干扰，Tanganelli采用双试剂法，试剂R1中含有GLDH、α-酮戊二酸、NADPH，消除内源性氨影响，再加试剂R2含肌酐亚氨基水解酶启动检测，为消除基质中其他脱氢酶（NADH）的影响，GLDH采用NADPH作辅酶。线性范围884 μmol/L，血清和尿液肌酐的平均回收率99%，肌酐335 μmol/L和80μmol/L时，批内 CV2%，批间 CV6%，肌酐亚氨基水解酶法 （y=0.987x-13.2）与Jaffe动力学法 （y=1.01x-12.8）结果相当，在去蛋白和Fuller’s土吸附后的Jaffe测试为（y=0.985x-3.08）。该原理仅需二步酶偶联反应，试剂组分少，影响因素和试剂成本下降，主要缺点是还原型辅酶Ⅱ不够稳定。

1.3.3 肌酐酰胺水解酶-肌酸脒基水解酶-Trinder反应法 1983年Fossati等报道了一个基于过氧化氢测量的新酶促比色法，在肌酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶（creatine amidinohydrolase，EC3.5.3.3）也称为肌酸酶（Creatinase）、肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，EC1.5.3.1）、过氧化物酶POD催化下，肌酐经肌酸、肌氨酸生成过氧化氢，再利用著名的Trinder反应，色原体为 3，5-二氯-2-羟基苯磺酸（钠）盐（DHBA）和 4-氨基苯腙，室温30 min内510 nm处比色测定。线性范围高达2.21 mmol/L，回收率平均99.8%，肌酐69 μmol/L时，批内CV3.3%，批间CV4.3%，与Wahlefeld的酶法紫外法和Fuller’s土Jaffe法结果一致（r大于0.99）。此检测波长为可见光，灵敏度高，线性范围宽，试剂组分简化，稳定性高，试剂成本下降，目前商品试剂盒多采用此法，是酶法的代表。

但指示系统也存在rinder反应固有的优缺点，除维生素C等，药物酚磺乙胺[4]、羟苯磺酸钙[5]可消耗过氧化氢形成明显负干扰，但酚磺乙胺对肌酐亚氨基水解酶-GLDH（紫外）酶法无影响[6]、羟苯磺酸钙对苦味酸法基本无干扰[7]。

1.3.4 N-甲基乙内酰脲酰胺水解酶-Trinder反应法1995年Ogawa等建立起一个基于通过N-甲基乙内酰脲的肌酐降解途径，原理如下：

肌氨酸再经肌氨酸氧化酶生成过氧化氢，POD催化Trinder反应，510 nm处比色测定。五个工具酶中N-甲基乙内酰脲酰胺水解酶 （N-methylhydantoin amidohydrolase，EC3.5.2.14）和N-氨基甲酰肌氨酸酰胺 水 解 酶 （N-carbamoylsarcosine amidohydrolase，EC3.5.1.59）是两个关键酶，其中N-甲基乙内酰脲酰胺水解酶打开咪唑啉环需消耗1分子ATP，酰胺水解酶需依赖ATP较少见。基质中氨和肌酸不参与反应，故特异性和灵敏度高，但国内该法的应用较少，可能与关键酶来源困难有关。

可见，酶法从根本上解决了反应特异性的问题，适于自动分析，是目前临床上检测Cr的主流方法，但仍存在内源、外源性干扰、试剂不稳定等问题，同时酶试剂成本比苦味酸试剂贵得多。

1.4 化学发光法与荧光匀相法

化学发光技术因其灵敏度高、线性范围宽、分析速度快等特点，替代同位素技术且无放射性污染而在临床上被快速应用，程武等建立了可手工检测肌酐的化学发光匀相法和荧光匀相法。化学发光匀相法的线性范围1 225 μmol/L，回收率100.2%，批内和批间为CV2.06%、3.29%；荧光匀相法的线性范围1 280 μmol/L，回收率为101.2%，批内和批间CV1.63%、4.27%。但尚未见临床应用的报道。

1.5 毛细管电泳法

毛细管电泳法检测肌酐的研究和应用仅十余年时间，张燕玲等用国产TH-2000毛细管电泳仪，将血清直接 （或过滤后）进行二氧化硅毛细管胶束电泳，235nm处紫外检测定量，线性范围25～1 600 μmol/L，高、中、低浓度的回收率分别为96.5%、99.4%、96.0%，批内、日内CV均小于5%，检出限12.3 μmol/L，与全自动生化分析仪 （碱性苦味酸法）测定结果相关系数r=0.997 7。赵绍林等实验显示，线性范围4.32～8840 μmol/L，回收率 99.6%，日内、日间 CV 均小于4.8%，检出限0.977 μmol/L。该方法简单快速，分离效果好，线性范围宽，困扰Jaffe法和酶法中的非特异性及尿素、尿酸、咖啡因、维生素C、血红蛋白、胆红素、脂血等的干扰问题都不存在，但相对于分光光度法需使用特殊设备，临床常规使用仍有不便。

1.6 拉曼散射法

2005年Rainer Stosch等提出了表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）法检测肌酐。以2-13C，2，3-15N2同位素标记的肌酐为内标，0.02 mol/L的NaCl诱导银胶体粒子发生部分聚集，20 μl反应液石英杯中混匀检测，以标记物肌酐和天然肌酐特征拉曼散射峰强度对比计算结果。CV小于2%。该原理与ID-MS类似，虽无需质谱仪，但因使用同位素，不便于常规检测。

1.7 电极法

利用离子选择电极制备相应的酶电极检测肌酐，是建立在酶促反应基础上的电化学技术。操作简单，速度快，适合POCT，但具有酶法抗内源性物质干扰能力较差的特点，临床应用较少。

1.8 高效液相层析（HPLC）法

HPLC通过阳离子交换层析柱分离肌酐，233～236 nm处检测。线性范围1～2000 μmol/L，回收率97%～102%。HPLC法分离性能强，大大降低了检测的非特异性和干扰，准确度和精密度均较Jaffe法和酶法高，但样品前处理及检测过程较繁琐，用时较长，不太适合临床大批量样本检测。IFCC将离子交换层析法确定为Cr测定的参考方法。

1.9 同位素稀释质谱（isotope dilution mass spectrometry，ID-MS）法

ID-MS是将已知质量和丰度的同位素标记物作为稀释剂与样本混合，平衡后通过质谱检测标记物混合前后同位素丰度的变化，计算样本中元素（或溶质）含量。ID-MS法不受基质效应等影响，特异性、准确度、精密度都很高，几乎无系统误差，是IFCC常用的决定性方法，其测定结果与真值最为接近。由于技术条件、辐射污染等问题，这类方法通常只用于产生一级参考测量程序、评价参考方法和对一级校标准品定值。

同位素稀释-气相色谱-质谱法（isotope dilutiongas chromatography mass spectrometry，GC-ID-MS）以13C和15N2肌酐作为标记物，通过阳离子交换柱分离提纯肌酐，再用GC-ID-MS检测。该方法的准确度高，但样本处理比较复杂，费时且成本高。

同位素稀释-液相色谱-质谱法（isotope dilutionliquid chromatography mass spectrometry，LC-ID-MS）样本经离心、沉淀蛋白质、过滤后便可直接进样检测，样本前处理较GC-ID-MS简单，且检测偏差与GCID-MS相当。国际上将此方法作为肌酐检测的决定性方法。

2 国内外血清肌酐检测参考测量系统及量值溯源性研究现状

国内外的能力验证PT和EQA执行的评价标准均依据CLIA’88允许误差范围，肌酐：靶值±26.5 μmol/L或靶值±15%（取最大值）。2005年Greg等报道，美国病理学家协会（CAP）发放血清标本检测肌酐，回收5 624有效结果 （约1125个实验室），ID-MS赋值79.7 μmol/L的标本，在50种仪器方法相同组内存在-5.3～27.4 μmol/L的偏差。目前，美欧等国对血清肌酐的参考测量系统经详细研究，采用GC-ID-MS和LC-ID-MS两种方法为肌酐定值以实现结果溯源。我国也已起步，继血清胆固醇检测具有比较完整的参考系统后，2013年颁布了我国卫生行业标准WS/T414-2013《血肌酐测定参考方法——同位素稀释液相色谱串联质谱法》，同年宋云霄等[8]对ID-MS、酶法和碱性苦味酸法比较显示，酶法与LC-ID-MS的测定结果可比性较好,Y酶法=0.964XIDMS+0.385，r=0.994,平均偏差-2.93%，Jaffe法结果明显偏高，与LC-ID-MS比较为YJaffe=0.955XIDMS+13.14，r=0.979，平均偏差 13.9%，溶血和高脂对酶法和Jaffe法均有干扰使结果偏低。2015年金中淦[9]对152家实验室进行肌酐正确度调查，依据国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM））推荐方法,应用LC-ID-MS方法赋值58.80umol/L的样本，酶法和Jaffe法的检测结果与相对偏移分别为67.60 μmol/L，14.97%；71.38 μmol/L，21.39%；LC-IDMS赋值300.69 μmol/L的样本，酶法和Jaffe法的检测结果与相对偏移分别为294.92 μmol/L，-1.92%；307.86 μmol/L，2.38%， 验证了 LC-ID-MS测定血清肌酐的方法准确度、精密度均较好，同时提示临床实验室低浓度肌酐检测的准确度和一致性值得重视；牛长春等[10]提出双浓度水平校准可纠正苦味酸法在低值范围存在的正偏移；李有强[11]对肌酐在不同检测系统间的测定不确定度和量值溯源进行了评估，结果显示具有可比性；欧阳后先[12]还研究了全自动生化分析仪丙氨酸转氨酶-肌酐（ALT-Cr）顺序检测会使肌酐结果显著偏高，可改换为α-L-岩藻糖苷酶-肌酐（AFU-Cr）顺序检测以消除；王正印等[13]总结了多种药物对Jaffe法与酶法带来正向或负向干扰，造成检测结果的偏倚。

方法的多样性是技术不断发展进步的必然结果，量值的溯源性是检验医学的永恒主题。临床上肌酐的检测方法、仪器、试剂（盒）种类各异客观存在，为使不同方法、系统之间的测定结果准确、可比，建立肌酐检测的体外诊断参考测量系统并保证ISO17511计量学溯源性，深入研究内源物质及药物对肌酐检测的干扰机制，不断追求检测结果的准确度和精密度，是国际国内肌酐检测的发展趋势。