Fas-FasL信号途径在ITP患者血小板凋亡中的作用研究

周国忠 罗洪强 董燕媛

原发性免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）临床表现为患者皮肤黏膜瘀斑、瘀点以及各种出血现象[1]。ITP为患者机体免疫功能紊乱和失衡等原因所导致的异质性自身免疫性疾病，长期用药往往会带来不良反应，严重影响患者的生活质量[2]。ITP的治疗方法包括靶向性治疗、免疫干预和免疫稳态重建等。ITP患者外周血中活化的淋巴细胞增多与血小板凋亡异常有重要关系。目前，临床尚未明确ITP患者T细胞凋亡的信号传导机制。本研究采用流式细胞术检测ITP患者外周血调节性T细胞（Treg细胞）比率与PLT，以及血小板表面Fas的表达和T细胞表面Fas配体（FasL）的表达，探讨Fas-FasL凋亡信号传导途径在ITP患者血小板异常凋亡中可能的作用机制，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年1月至2017年4月本院血液科门诊或住院的ITP患者32例（ITP组），ITP诊断根据血液和骨髓检查确诊，符合成人ITP诊断标准[3]。另择同期来本院行健康体检者32例为正常对照组，排除ITP及其它自身免疫性疾病。ITP组男14例，女18例；年龄16～75岁，中位年龄34.8岁。正常对照组男13例，女19例；年龄19～68岁，中位年龄32.6岁。两组受检者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 CD4－FITC、CD127－PE、CD25－PEcy5、CD8－FITC购自美国BD公司。CD41－FITC购自美国 Backman Coulter公司。Fas－PE、FasL－PE 和同型对照IgG1－FITC、IgG1－PE 购自北京Immunotech公司。溶血试剂购自美国库尔特公司。FC500型流式细胞仪和EPICS Q－PREP溶血仪均购自美国库尔特公司。

1.2.2 外周血T细胞与血小板的分离 采集ITP组患者（用药治疗前）与正常对照组受检者外周静脉血3ml，EDTA－K2抗凝。先以1 000 r/min离心全血2 min，提取富含血小板的血浆，再以3 000 r/min离心血浆5min提取血小板悬液，流式细胞仪检测PLT，RPMI 1640培养液调整血小板浓度约2×106/ml。以FICOLL分离液分离出单个核细胞，采用溶血素溶解RBC，用10%的小牛血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度约为2×106/ml。

1.2.3 T细胞FasL测定 取2支试管，各加入100μl单个核细胞悬液，2管分别加入CD4－FITC、FasL－PE和CD8－FITC、FasL－PE，以上各管配备相应的对照管。混匀，4℃避光 15min，PBS洗涤 1次，各管加入 600μl PBS缓冲液，上流式细胞仪检测CD4+FasL+细胞比率、CD8+FasL+细胞比率。

1.2.4 血小板Fas测定 取2支试管，各加入100μl血小板悬液，分别加入 20μl CD41－FITC、20μl IgG1－PE 和20μl CD41－FITC、20μl Fas－PE，混匀，4℃避光 15min，PBS洗涤1次，各管加入600μl PBS缓冲液，上流式细胞仪检测CD41+Fas+血小板比率。

1.2.5 Treg细胞检测 取1支试管，加入100μl单个核细胞悬液，分别加入 20μl CD4－FITC、5μl CD127－PE 和10μl CD25－PEcy5，配备相应的对照管。混匀，4℃避光15min，PBS洗涤1次，各管加入600μl PBS缓冲液，上流式细胞仪检测Treg细胞比率。

1.3 观察指标 观察并比较ITP组患者与正常对照组受检者CD4+FasL+细胞比率、CD8+FasL+细胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT与Treg细胞比率，并分析ITP组患者以上5种指标的相关性。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ITP组患者与正常对照组受检者CD4+FasL+细胞比率、CD8+FasL+细胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT 与Treg细胞比率比较 见表1。

表1 ITP组患者与正常对照组受检者CD4+FasL+细胞比率、CD8+FasL+细胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT与Treg细胞比率比较

由表 1可见，ITP组患者CD4+FasL+细胞比率、CD41+Fas+血小板比率均高于正常对照组受检者（均P＜0.05），PLT与Treg细胞比率均低于正常对照组受检者（均P＜0.05）。ITP组患者与正常对照组受检者CD8+FasL+细胞比率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 ITP组患者CD4+FasL+细胞比率、CD8+FasL+细胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT与Treg细胞比率相关性分析 见表2。

表2 ITP组患者CD4+FasL+细胞比率、CD8+FasL+细胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT与Treg细胞比率相关性分析（相关系数r）

由表2可见，ITP组患者PLT与CD4+FasL+细胞比 率、CD41+Fas+血小板比率均呈负相关（均P＜0.05），与Treg细胞比率呈正相关（P＜0.05）。Treg细胞比率与CD41+Fas+血小板比率呈负相关（P＜0.05）。

3 讨论

ITP是免疫功能紊乱造成血小板减少的出血性疾病[4-5]。本研究通过对患者淋巴细胞膜表面相关分子水平检测，分析T淋巴细胞活化途径介导的血小板细胞凋亡机制在ITP患者发病中的可能作用。

细胞凋亡途径有Fas-FasL途径、P53途径和TNFR/TNF途径等,而以Fas-FasL途径介导的细胞凋亡紊乱是体液和细胞免疫失衡的主要原因[6]。Fas又称APO-1（CD95分子），是肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体家族成员，是Ⅰ型细胞膜蛋白，能通过死亡域间作用并促进聚合而诱导凋亡，又称为死亡分子。FasL是肿瘤死亡因子相关的Ⅱ型跨膜蛋白，是Fas抗原的天然配体[7]。Fas与FasL相互作用是细胞凋亡的重要途径之一。FasL阳性的细胞毒性T细胞与表达Fas的靶细胞接触，可诱导靶细胞程序化死亡[8]；而Fas/FasL介导的凋亡机制在ITP发生、发展中仍未完全阐明，值得深入研究。本研究采用流式细胞术检测了ITP患者T细胞亚群FasL蛋白的表达，结果显示T细胞各亚群FasL表达均升高。与正常对照组受检者相比，ITP患者外周血CD4+FasL+细胞比率高，CD41+Fas+血小板比率也高。这说明高表达Fas的血小板可与活化的T细胞上FasL结合,T细胞可通过Fas－FasL途径直接介导血小板凋亡。此外，本研究结果显示，同样属于T淋巴细胞，CD4+T细胞在ITP的Fas－FasL介导的凋亡发病机制中占主要作用，CD8+T细胞作用不明显。

Treg细胞有免疫应答低下和免疫抑制的功能，可抑制T、B细胞的活化、增殖和自身抗体的产生，在免疫性疾病发生、发展中起重要作用[9]。目前Treg细胞在ITP发病机制中的作用受到重视。Treg细胞约占外周血CD4+T细胞的5%～10%。根据不同的免疫表型，Treg细胞主要包括：CD4+CD25+Treg细胞、Tr1型CD4+Treg细胞、Th3型CD4+Treg细胞和CD8+Treg细胞等亚群[10]。本研究结果显示，与正常对照组受检者相比，ITP组患者外周血Treg细胞比率明显降低；ITP组患者PLT与Treg细胞比率呈正相关。这说明ITP患者中血小板特别低的，外周Treg细胞比率明显减少；当ITP患者处于缓解期时，Treg细胞比率会增高。因此Treg细胞比率或可作为ITP患者预测预后的指标来指导临床治疗。

综上所述，血小板高表达Fas可与激活的T细胞表面FasL结合，T细胞可通过Fas-FasL途径直接介导血小板凋亡。本研究结果表明，Fas、FasL表达异常在ITP患者免疫功能紊乱、T细胞亚群及血小板凋亡中起重要作用。