韩氏内异止痛汤对子宫内膜异位症大鼠模型雌二醇和芳香化酶P450表达的影响

韩亚光，朱小琳，韩延华

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院妇科，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院治未病中心，哈尔滨 150040）

子宫内膜异位症是一种常见的妇科疾病，是指子宫内膜组织生长在子宫腔被覆内膜及子宫肌层以外的部位出现、生长、浸润、反复出血，可形成结节及包块，引起疼痛、不孕等病症。流行病学发现，子宫内膜异位症在育龄期妇女中患病率高达10%～15%，并且有逐年上升的趋势，已经成为严重影响妇女身体和心理健康的疾病之一。研究发现，子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，受雌激素调节影响[1]。雌激素的长期作用可刺激异位内膜的增殖与生长。作为细胞外信号的雌激素，只有与雌激素受体（ER）结合后才能发挥其生物学效应。芳香化酶P450 是雌激素合成的最后一步限速酶，可促进C19 雄激素转化为雌激素。有研究发现，异位内膜与在位内膜中芳香化酶P450 表达升高，由于异位内膜中17pHSD2 含量过少，进而导致雌激素和雌二醇浓度明显增高[2]。龙江韩氏妇科认为子宫内膜异位症以肝脏功能失调为主，与脾、肾两脏密切相关，治疗应从整体和局部出发，结合临床症状，采用疏肝活血祛瘀止痛法，创立“内异止痛汤”，同时针对不同个体辨证施治加减运用，在临床上或得很好的疗效。本研究将采用自体移植法建立EMs 大鼠模型观察中药内异止痛汤对内异症血清中E2和异位内膜组织匀浆液中ER、芳香化酶P450的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 性成熟雌性清洁级SD 大鼠65 只，体质量为220 g 左右，鼠龄在7 ～8 周左右，购自黑龙江中医药大学实验动物中心（药物安全性评价中心）[SCXK（黑）2013-004]。饲养于黑龙江中医药大学针灸验室，清洁级环境，每6 只大鼠一笼进行饲养，自由摄食和饮水，实验室温度：（22±2）℃，湿度：40%～60%，规律性光照：12 h 光照、12 h 黑夜，1 次/5 d 更换垫料。连续阴道涂片，观察大鼠的动情周期，在所有大鼠的第三个动情周期时随机选取57 只SD大鼠进行自体移植手术，建立子宫内膜异位症模型，剩余8 只SD 大鼠设为假手术组。

1.2 建立EMs 大鼠模型 术前24 h 大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 mL/kg，使其处于动情期[3]。手术在无菌环境下进行，按Vernon 等[4]的方法进行自体移植法手术建立模型。

1.3 试验药物 1）中药复方内异止痛汤主要药物组成：当归15 g，白芍20 g，三棱10 g，莪术10 g，丹参20 g，桃仁15 g，连翘15 g，五灵脂10 g，延胡索20 g，香附15 g，鳖甲20 g，桂枝10 g，炙甘草10 g。药物为中药天江颗粒。中药由黑龙江中医药大学附属第一医院门诊中药局提供，江阴天江公司生产。2）达那唑胶囊0.2 g×30 粒，购自江苏联环药业股份有限公司。

1.4 分组与给药 将造模成功后的40 只大鼠随机分为4组：模型对照组10 只，中药复方内异止痛汤低剂量组10 只，中药复方内异止痛汤高剂量组10 只，阳性对照组（达那唑）10 只，另外假手术组8 只。根据《药物实验方法学》[5]，模型对照组和假手术组都给予生理盐水2 mL/d 灌胃，达那唑组7.2 mg/kg/d灌胃，低剂量组给予245.8 mg/kg/d 灌胃，高剂量组给予985.3 mg/kg/d 灌胃，连续灌胃4 周。

1.5 实验试剂 雌二醇（E2）试剂盒、雌激素受体（ER）试剂盒、芳香化酶P450 试剂盒，均由北京华英生物技术研究所提供。

1.6 指标测定

1.6.1 酶联免疫吸附法检测E2、ER、芳香化酶P450 EMs 大鼠模型血清中的E2以及异位内膜组织匀浆液中的ER、芳香化酶P450 用酶联免疫吸附法进行定量测定，严格按照试剂盒说明书操作进行，取药物干预后各组血清及内膜组织匀浆液入2 mL EP 管中，放入- 20 ℃冰箱备用。试验开始前30 min 将样品和试剂盒移至室温稳定。取出酶标板，设一个空白对照孔，不加任何液体，每个标准点依次各设两孔，加标准品每孔50 μL，依次为0 pg/mL，40 pg/mL，100 pg/mL，240 pg/mL，400 pg/mL，1 000 pg/mL；除空白对照组其余每孔加酶结合物（HRP-conjugate）50 μL，再按相同顺序加入抗体（antibody）50 μL；贴上不干胶封条，摇匀；37℃温育60 min；洗板3 次（间歇30 s）；每孔先加显色剂A50 μL，再加显色剂B50 μL，摇匀，37℃避光显色15 min；每孔加终止液50 μL，终止反应。最后用450 nm 波长处读取吸光度值，绘制标准曲线，用Curve Expert 1.4 软件换算浓度。

1.7 统计方法 使用SPSS 17.0 统计软件对所得数据进行分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间差异性比较用单因素方差分析。评定标准P＜0.05为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 治疗后各组大鼠异位病灶生长情况

表1 各组大鼠异位内膜病灶体积变化（± s ） mm3

表1 各组大鼠异位内膜病灶体积变化（± s ） mm3

注：各治疗组治疗后与治疗前比较，## P ＜0.01；与低剂量组治疗后比较，# P ＜0.05；与西药组治疗后比较，△P ＞0.05；与模型组治疗前比较，▲P ＞0.05

组 别 给药量/（mg/kg） 治疗前 治疗后 体积变化模型组-108.72±23.43105.26±26.21▲ 3.46±6.70中低组 245.8 106.39±27.36 48.76±15.17##57.63±20.39中高组 985.3 110.23±21.01 28.99±9.01## 81.24±23.67#△西药组 7.2 116.52±27.37 28.81±8.85## 87.71±25.61

造模成功后，各组大鼠治疗4 周后二次开腹，测量异位病灶组织大小，采取同侧与用药前比较，结果提示：模型组治疗前后子宫内膜异位病灶的组织囊肿体积无显著改变（P＞0.05）；中药高剂量、中药低剂量和西药组子宫内膜异位病灶与治疗前相比，体积明显缩小，有统计学意义，（P＜0.01）；中药高剂量治疗组异位病灶体积缩小程度明显优于中药低剂量治疗组（P＜0.05）；其与西药组相比体积大小无明显差别（P＞0.05）。结果见表1。

图1 各组大鼠异位内膜病灶体积变化

2.2 内异止痛汤对EMs 大鼠血清中E2的影响 各组大鼠血清中E2酶联免疫法检测结果显示，与模型组比较，内异止痛汤低剂量组E2含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；内异止痛汤高剂量组和西药组与模型组相比，E2含量明显降低（P＜0.01）；与内异止痛汤低剂量组相比，内异止痛汤高剂量组对EMs 模型大鼠血清E2含量降低更为显著（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清中E2 结果（± s）

表2 各组大鼠血清中E2 结果（± s）

注：与模型组比较，## P ＜0.01，# P ＜0.05；与低剂量组比较，△P ＜0.05

组 别 例数 E2西药组 10 136.945±11.015##低剂量组 10 159.869±12.146#高剂量组 10 144.652±6.341##△模型组 10 175.562±8.438假手术组 8 116.983±4.892

2.3 内异止痛汤对EMs 大鼠异位内膜组织中ER、芳香化酶P450 的影响 各组大鼠异位内膜组织匀浆液中ER 和芳香化酶P450 酶联免疫法检测结果显示，与模型组比较，内异止痛汤低剂量组ER 和芳香化酶P450 含量降低（P＜0.05）；内异止痛汤高剂量组和西药组与模型组相比，ER 和芳香化酶P450 含量明显降低（P＜0.01）；与内异止痛汤低剂量组相比，内异止痛汤高剂量组对EMs 模型大鼠异位组织中ER和芳香化酶P450 含量降低更为显著（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠异位内膜组织匀浆液中ER、芳香化酶P450 结果（± s）

表3 各组大鼠异位内膜组织匀浆液中ER、芳香化酶P450 结果（± s）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与低剂量组比较，△P ＜0.05

组 别 例数 ER 芳香化酶P450西药组 10 35.553±2.339## 295.289±8.957##低剂量组 10 40.147±2.808# 320.463±20.073#高剂量组 10 36.907±3.105##△ 296.308±18.617##△模型组 10 43.951±2.568 343.364±12.573假手术组 8 31.711±1.024 285.441±4.728

3 讨论

3.1 雌激素在子宫内膜异位症中发挥作用的途径 雌激素为细胞外信号，只有与雌激素受体结合后才能表现出生物学效应，最早认为雌激素主要受雌激素受体的两个亚基α 和β 调控，其以自由扩散的形式与雌激素受体结合，形成复合物进入细胞核，然后与指定的DNA 序列结合，最后启动转录，由于这一系列过程需要数小时来完成，故称为长期效应。Razandi 等[6]研究发现，雌激素受体α 和β 不仅在细胞内表达，在细胞膜上也发现了雌激素受体的分布，但只占总体的2%～3%。有学者研究发现，雌激素与细胞膜ER 结合后可引起一系列下游信号传导，导致细胞的生长与增殖[7]。然而雌激素膜受体被慢病毒转染后，内异症患者子宫内膜间质细胞的生长与增殖明显被抑制[8]。提示雌激素可能直接与膜受体结合后激活信号通路发挥相应的生物学效应。因此雌激素可通过2 种途径发挥其生物学效应。

在子宫内膜异位症中雌激素可以通过经典基因转录效应在细胞核内完成其生物学效应，雌激素受体作为信号传导者与雌激素结合活化，并与雌激素效应元件（ERE）结合，调控基因的表达，使细胞生长和增殖，降低E2的表达可以阻断这一通路[9]。雌激素也可以通过非经典转录效应与细胞膜受体结合，使Ras-Raf 激活并磷酸化下游底物MEK、ERK。磷酸化的ERK 进入细胞核后可激活核转录因子NF-κBp65、NF-κBp50、c-Jun、c-Fos 的表达，引起细胞的异常增殖。

3.2 内异止痛汤对EMs 大鼠血清中E2的影响 子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，人体内的雌激素以雌二醇活性最强。异位内膜中的雌二醇表达异常升高，可持续刺激异位病灶，使异位内膜不断的增生，侵袭。有学者发现，随着痛经程度的加重，雌二醇水平不断增高，重度患者血清中的雌二醇明显高于轻度患者。有研究发现，中药单体或复方通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴，或作用性激素受体等方式，可抑制异位内膜的生长甚至促进其萎缩。如金雀异黄素可通过降低子宫内膜异位症大鼠雌激素生成代谢酶P450，降低雌二醇水平，改善高雌激素水平。黄绮丹等[10]研究发现，西药达那唑和中药复方莪棱胶囊均可降低子宫内膜异位症大鼠血清中的雌二醇水平，从而改善内异症的相关症状。李红霞等[11]在临床上发现，三花益肾汤治疗子宫内膜异位症患者后，血清中雌二醇、CA125等指标明显下降，孕激素上升，从而使病灶缩小。本研究发现，各组药物干预后，中药复方内异止痛汤高剂量组、低剂量组和西药组与模型对照组相比，都能明显的降低EMs 大鼠血清中雌二醇水平，高剂量组比低剂量组疗效明显。此结果提示，中药复方内异止痛汤可能通过降低子宫内膜异位症患者血清中的雌二醇，从而抑制异位内膜的增殖与生长，并且存在明显的浓度依赖性。

3.3 内异止痛汤对EMs 大鼠组织匀浆液中芳香化酶P450 的影响 芳香化酶P450 是由血红蛋白和酶蛋白组成的一种细胞色素，属于细胞色素P450 超家族。子宫内膜癌、子宫内膜异位症、子宫腺肌病等一些雌激素依赖性疾病的病理组织中均有芳香化酶P450 的表达，说明与这些疾病的发生发展有关。芳香化酶P450在子宫内膜的患者体内各个合成雌激素的环节都有表达[12]。在异位内膜和在位内膜都呈现高表达[13]，但在健康妇女的子宫内膜和肌层中都不表达[14]。芳香化酶P450 是雌激素合成的最后一步限速酶，可促进C19 雄激素转化为雌激素。

本部分实验提示，中药复方内异止痛汤可显著的抑制EMs 大鼠异位内膜组织匀浆液中芳香化酶P450的表达，并且高剂量组疗效优于低剂量组，有统计学差异（P＜0.05），证明疗效与药物浓度有关。说明中药复方内异止痛汤可能通过抑制芳香化酶P450 来阻断与雌二醇正反馈循环，从而降低雌二醇的分泌，抑制或减少异位内膜的增殖和生长。

3.4 内异止痛汤对EMs 大鼠组织匀浆液中雌激素受体ER 的影响 子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，雌激素能发挥多大的生物学效应，取决于靶细胞内雌激素受体的高低。雌激素在子宫内膜异位症中可通过两种途径进行信号传导：1）基因转录：雌激素进行信号传导是通过雌激素受体反应元件（ERE）进行的，细胞质中的雌激素受体与配体结合后发生构型的改变，以同聚体或异聚体的形式与雌激素受体反应元件结合，进而启动相应的转录过程。2）非基因转录：雌激素与细胞膜雌激素受体结合后，激活信号通路，对其起到自身负反馈调节作用，调节如NF-κB和AP-1 等转录因子的活性，对目的基因进行转录或调控，参与细胞生物学效应。雌激素可直接影响异位内膜，也可通过一些转录因子的表达来促进异位内膜的发展。Vivacqua 等[15]研究证实，雌激素通过激活ER-α 调控内膜细胞的增殖与生长。Bukulmez 等[16]发现子宫内膜异位症患者的异位内膜组织中ER-α 表达升高。

本研究发现，中药复方内异止痛汤高剂量组、低剂量组与模型对照组相比都能够显著降低EMs 大鼠异位内膜组织匀浆液中ER 的表达，并且高剂量组优于低剂量组（P＜0.05）。此结果提示：中药复方内异止痛汤可能通过抑制ER 的表达，从而降低雌二醇，抑制异位内膜的生长与增值。

综上分析，中药复方内异止痛汤可通过降低雌激素受体ER 的表达进而抑制雌二醇E2的生物学效应，减少异位病灶的生长与增值。另外中药复方内异止痛汤还可通过降低芳香化酶P450 的表达来阻断与E2之间的正反馈循环，从而降低异位内膜中E2的含量。

因此，雌激素对异位病灶的生物学信号减少，阻断了异位内膜的增殖与生长，提高了异位病灶的凋亡率，这有可能是中药复方内异止痛汤治疗子宫内膜异位症的机理之一。