顶空-固相微萃取法与水蒸气蒸馏法提取沙棘挥发油组分的比较研究

张鹏云，李 蓉，卢俊文，张朋杰，陈丽斯，张 峰

(1.中山出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，广东 中山 528400；2.广东药科大学 公共卫生学院，广东 中山 528458；3.中国检验检疫科学研究院 食品安全研究所，北京 100176)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)又名酸刺，是胡颓子科沙棘属植物的干燥成熟果实，是一种药食同源植物[1]，在抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、保护心脑血管系统、增强免疫力等方面具有明显的药理作用，并广泛应用于化妆品、医药保健品、食品等领域，具有较高的经济价值[2-5]。此外，沙棘适应能力强，耐旱、耐寒、耐盐碱、抗风沙，对生态环境的改善也具有积极作用，主要在我国的西北、西南、东北等地区种植[6]。近些年人们对沙棘的研究主要集中在黄酮类、氨基酸、脂肪酸等化学成分[7]，而对于其挥发油的报道相对较少，如杜然等[8]利用超临界CO2萃取法从西藏产沙棘中提取挥发油，并鉴定出14种化合物，主要成分为不饱和脂肪酸；卢金清等[9]采用水蒸气蒸馏法结合气相色谱-串联质谱技术提取并鉴定沙棘挥发油成分，最终鉴定出46个组分，主要成分为脂肪酸类化合物；胡兰等[10]利用水蒸气蒸馏法提取新疆两个产地的沙棘挥发油，分别鉴定出44种和50种组分，主要成分为烷烃类和醇类化合物，两者有17种共同组分。由此看出不同产地沙棘挥发油所含化合物种类及含量差异较大。

顶空-固相微萃取技术(HS-SPME)是近些年发展起来的前处理方法，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，具有操作简便、样品使用量少、无需溶剂、易实现自动化、分析速度快[11]等优势。而传统的水蒸气蒸馏法(SD)使用的装置简单、易操作、避免了有机溶剂萃取造成的污染，但该方法温度高、耗时长、易出现焦糊现象，且挥发油得率低[12]。因此本研究利用HS-SPME法萃取沙棘挥发性成分，并比较了HS-SPME法和SD法对沙棘挥发油化学成分的影响，以期得出2种提取方法的共同点和差异性，为沙棘的鉴别与品质评价提供技术保障，为其进一步研究开发提供基础数据。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

沙棘干药材(产地：内蒙古，批号：180201)，水分为7.8%，总灰分为3.8%，购自湖南省南国药都中药饮片有限公司。氯化钠、无水硫酸钠、正己烷均为分析纯，购自广州化学试剂厂；正构烷烃混合标准品(C7～C40，美国o2si公司)。

1.2 仪器与设备

TSQ 8000气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Thermo公司)：配电子电离源及Xcalibur数据处理系统、TRIPLUS RSH自动进样器、固相微萃取自动进样手柄、20 mL顶空样品瓶(配有聚四氟乙烯垫的螺纹密封盖)；DVB/CAR/PDMS固相微萃取头(50/30 μm，美国Supelco公司)。

1.3 样品前处理

1.3.1 顶空固相微萃取法准确称取2.0 g沙棘置于20 mL顶空瓶中，用自动进样器将顶空瓶置于70 ℃孵化炉中平衡20 min，再将老化过的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入样品瓶顶空部分热吸附50 min，之后将吸附后的萃取头插入气相色谱进样口，于250 ℃条件下解吸7 min，最后进GC-MS系统分离检测。

1.3.2 水蒸气蒸馏法准确称取200.0 g沙棘放入2 000 mL圆底烧瓶中，加入1 500 mL饱和氯化钠溶液，浸泡过夜，参照2015版《中国药典》一部挥发油测定法甲法提取5 h，静置30 min，加入2 mL正己烷萃取，在萃取液中添加适量无水硫酸钠除水干燥，过0.45 μm有机滤膜后作为样品储备液，稀释10倍后进GC-MS系统分离检测。

1.4 仪器条件

1.4.1 顶空固相微萃取法色谱条件：TR-PESTICIDE弹性石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至190 ℃，再以3 ℃/min升至225 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃并保持3 min；分流比10∶1，流速1.2 mL/min；进样口温度为250 ℃；载气： 高纯度(99.999%)氦气。

质谱条件：EI离子源；离子源温度：280 ℃；传输线温度：280 ℃；电子轰击能量：70 eV；扫描方式：全扫描(Scan)；质量扫描范围m/z40～450，溶剂延迟4.0 min。

1.4.2 水蒸气蒸馏法色谱条件：TR-PESTICIDE弹性石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min升至190 ℃，再以3 ℃/min升至225 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃并保持10 min；分流进样，分流比10∶1，流速1.2 mL/min；进样口温度为250 ℃；载气：高纯度(99.999%)氦气；进样量1 μL。

质谱条件与“1.4.1”相同。

1.5 数据处理

1.5.1 保留指数的计算C7～C40正构烷烃混标与沙棘样品在相同的气相条件下得到总离子流图后，工作站根据公式自动得出各挥发性组分的保留指数。保留指数的计算公式如下：

RI=100n+100(RTx-RTn)/(RTn+1-RTn)

式中：RI为待测化合物的保留指数；n为正构烷烃的碳原子数；RTx为待测化合物的保留时间(min)；RTn和RTn+1分别为碳原子数为n、n+1正构烷烃的保留时间(min)，且RTn+1>RTx>RTn。

1.5.2 定性分析将得到的总离子流图通过自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)进行处理，所分辨的质谱在NIST2.2标准谱库中检索，根据匹配度和保留指数进行核对，只记录正匹配和反匹配均大于800的化合物，并用峰面积归一化法计算沙棘各挥发性物质的相对含量。

1.5.3 数据统计与图像处理本研究的数据统计和图像处理均在Microsoft Excel表格中完成。扣除总离子流图中的杂质和柱流失的峰后，对目标峰进行积分，再利用软件将具体信息导入Excel表格中，即得到各条件下的沙棘挥发性物质的峰面积和峰数目。

2 结果与讨论

2.1 顶空-固相微萃取条件的优化

据文献报道，顶空-固相微萃取法中的萃取温度、萃取时间、解吸时间、平衡时间等条件对挥发性成分的萃取效果影响显著[13]。本研究以峰面积代表萃取物质的量，出峰数代表萃取物质的种类，通过总峰面积和总峰数来评价萃取效果，确定HS-SPME萃取沙棘挥发油成分的较优条件。

2.1.1 萃取温度的选择准确称取沙棘2.0 g于20 mL顶空瓶中，在萃取时间为30 min，解吸时间为3 min，平衡时间为10 min的条件下，考察不同萃取温度(40、50、60、70、80 ℃)的萃取效果，每个水平重复3次。结果显示，随着萃取温度的升高，沙棘挥发性物质的总峰面积不断增大，且当温度超过70 ℃时，总峰面积急剧上升；而出峰数目随萃取温度的升高呈先增加后降低的趋势，并在70 ℃时达到最大。研究发现当萃取温度达到80 ℃时，保留时间靠后的几个组分的峰响应突然变大，峰面积约为70 ℃时的4倍，而先出峰的一些组分响应却降低，且峰形变差，因此造成80 ℃下挥发性成分的总峰面积较大，峰数目却减少的结果。这可能是因为在低温条件下，挥发性物质在基质间扩散缓慢，需较长时间才能达到动态平衡，当温度升高后挥发性组分的运动速率加快，更加有利于萃取头对目标物的富集吸附[14-15]。但温度过高会使低沸点组分在竞争吸附中处于劣势地位，造成部分化合物流失[16]。考虑到萃取效果的全面性，本研究选定70 ℃为较优萃取温度。

2.1.2 萃取时间的选择实验考察了不同萃取时间(30、40、50、60 min)对沙棘挥发性成分萃取效果的影响。结果显示，当萃取时间为30～50 min时，总峰面积和峰数目均随着萃取时间的增加而逐渐增大，而当萃取时间为60 min时，虽然总峰面积略有增加，但出峰数却明显降低，这是因为随着萃取时间的延长，分析物逐渐在萃取头、顶空和样品3相中达到平衡，然后被萃取头吸附[17]。当萃取时间不足时，目标物被吸附不充分；若萃取时间较长，已经被萃取头吸附的挥发性组分可能逸出，出现解吸附现象[18]。综合考虑，本研究选择萃取时间为50 min。

2.1.3 解吸时间的选择在确定萃取温度、萃取时间的基础上，考察了不同解吸时间(3、5、7、9、11 min)的萃取效果。结果显示，当解吸时间由3 min增加到5 min时，总峰面积和总峰数均略有增加；而解吸时间大于5 min后，总峰面积和总峰数均无显著变化。这是由于解吸时间较短时，待测物解吸不完全，不但影响检测结果，还会污染后续样品[19]；解吸时间过长时，虽然挥发性组分能够充分解吸，但会导致峰形变宽，部分组分发生氧化，缩短萃取头的使用寿命[14-15,20]。综合考虑，本研究选择解吸时间为7 min。

2.1.4 平衡时间的选择实验考察了不同平衡时间(10、15、20、25、30 min)的萃取效果。结果显示，随着平衡时间的增加，总峰面积和出峰数的总体变化不明显。当平衡时间超过10 min时，总峰面积稍有增加，在20 min时达到最大值。表明20 min时挥发性物质在气相中已达到平衡状态，因此本研究选择平衡时间为20 min。

图1 HS-SPME(A)和SD法(B)提取物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of HS-SPME(A) and SD(B) extracts

2.2 HS-SPME/GC-MS法检测结果与分析

在优化后的HS-SPME萃取条件下对沙棘挥发性成分进行提取并通过GC-MS检测，得总离子流图(图1A)，再利用AMDIS和保留指数进行定性分析。最终检出106个峰，鉴定出76种组分，占挥发性物质总含量的90.19%，包含20种酯类(31.84%)、17种醛类(31.51%)、9种酮类(10.30%)、13种烯烃类(6.44%)、7种醇类(5.86%)以及10种其他种类化合物(4.25%)。其中，含量最高的组分为甲基十六碳-9-烯酸酯(9.42%)，其次为壬醛(9.40%)、糠醛(7.24%)、棕榈酸甲酯(5.96%)。

2.3 SD/GC-MS法检测结果与分析

对SD法提取的沙棘挥发油成分采用GC-MS检测得到沙棘挥发油总离子流图(图1B)。结果显示，提取物中共检出93个峰，鉴定出56种组分，占挥发性物质总峰面积的91.98%(表1)，主要为21种酯类化合物(83.74%)、7种烯烃类化合物(4.25%)、5种酮类化合物(0.59%)、5种醛类化合物(0.98%)、2种有机酸类化合物(0.72%)、3种醇类化合物(0.56%)和13种其他种类化合物(1.13%)。其中有4种组分的相对百分含量超过10%，分别是甲基十六碳-9-烯酸酯(18.61%)、棕榈酸甲酯(16.21%)、亚油酸甲酯(13.41%)、(Z)-9-十八烯酸甲酯(12.78%)，这4种酯类化合物占挥发性组分总量的61.01%，构成了沙棘挥发油的主要成分。

表1 HS-SPME法和SD法提取得到的沙棘挥发性成分Table 1 Extraction of the volatile components from Hippophae rhamnoides L.by HS-SPME and SD method

(续表1)

No.FormulaComponentRetentionindexRelativecontent(%)RIexpRIlit[22]HS-SPMESD30C10H18OMenthone(胡薄荷酮)115811540.19-31C9H16O(E)-2-Nonenal(反式-2-壬烯醛)116411620.61-32C9H20O1-Nonanol(1-壬醇)117611730.14-33C10H18OL-4-terpineol(L-4-萜品醇)118411820.49-34C10H8Naphthalene(萘)119111820.63-35C10H18Oα-Terpineol(α-松油醇)11951189-0.0336C10H14OSafranal(藏花醛)120512010.470.0137C10H20ODecanal(癸醛)120812060.48-38C10H20O2Nonanoicacid,methylester(壬酸甲酯)122712251.37-39C12H18O2trans-Chrysanthenylacetate(反式-乙酸菊烯酯)123912390.36-40C10H16OPulegone(长叶薄荷酮)124612370.40-41C10H12O2Phenethylacetate(乙酸苯乙酯)126312580.37-42C9H18O2Nonanoicacid(壬酸)12671273-0.0243C12H20O2Bornylacetate(乙酸龙脑酯)129012850.95-44C11H14O2Isobutylbenzoate(苯甲酸异丁酯)131013210.45-45C13H161,1,6-Trimethyl-1,2-dihydronaphthalene(1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘)136113540.140.0246C14H303-Methyltridecane(3-甲基十三烷)136913710.20-47C13H18Oβ-Damascenone(大马士酮)13781386-0.0248C15H24Copaene(可巴烯)138213760.43-49C15H24β-Bourbonene(β-波旁烯)139213840.70-50C12H24ODodecanal(月桂醛)141214090.11-51C15H24α-Cedrene(α-雪松烯)142114110.69-52C15H24Caryophyllene(石竹烯)142714191.13-53C13H20Oα-Ionone(α-紫罗酮)143514261.210.1054C12H16O2Isopentylbenzoate(苯甲酸异戊酯)14371439-0.0455C15H24Calarene(白菖烯)144014320.42-56C12H16O2Isopentylbenzoate(苯甲酸异戊酯)144514390.52-57C13H22Otrans-Geranylacetone(反式-香叶基丙酮)145814530.84-58C13H20Oβ-Ionone(β-紫罗酮)14781486-0.0959C15H24γ-Muurolene(γ-衣兰油烯)148414770.52-60C15H22α-Curcumene(α-姜黄烯)148714830.340.0361C10H16O25,6-Dihydro-6-pentyl-2H-pyran-2-one(5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮)149015014.25-62C15H24Valencene(朱栾倍半萜)150114920.15-63C15H24α-Muurolene(α-衣兰油烯)150814990.38-64C15H281-Pentadecyne(1-十五炔)15101518-0.1565C13H26OTridecanal(十三醛)151415120.83-66C15H24β-Cadinene(β-荜澄茄烯)15191518-0.0467C15H24γ-Cadinene(γ-荜澄茄烯)152215130.29-68C13H26O2Dodecanoicacid,methylester(十二酸甲酯)152715260.24-69C15H24δ-Cadinene(δ-荜澄茄烯)153215240.83-70C15H24Dauca-4(11),8-diene153915320.26-71C15H20α-Calacorene(α-二去氢菖蒲烯)15411542-0.0372C11H16O2Dihydroactinidiolide(奇异果内酯)154715321.44-73C15H24OCaryophylleneoxide(石竹烯氧化物)159615810.74-74C14H28OTetradecanal(十四烷醛)161616131.43-75C15H26Oα-Cadinol(α-毕橙茄醇)16561653-0.1076C16H182,2′,5,5′-Tetramethyl-1,1′-biphenyl(2,2′,5,5′-四甲基联苯)16721663-0.4477C16H161,3-Diphenyl-1-butene(1,3-二苯基-1-丁烯)1679--0.1378C15H30O1-Pentadecanal(十五醛)171817150.300.6779C15H30O2Methyltetradecanoate(肉豆蔻酸甲酯)172817250.830.7580C16H26O2,6-Ditert-butyl-4-ethylphenol(2,6-二叔丁基-4-乙基苯酚)17601754-0.0881C14H10Phenanthrene(菲)17781775-0.0882C16H32O2Tetradecanoicacid,ethylester(十四酸乙酯)17921794-0.1183C20H422,6,10,14-Tetramethylhexdecane(2,6,10,14-四甲十六烷)18061792-0.0784C16H32OHexadecanal(十六醛)182018170.59-85C16H32O2Pentadecanoicacid,methylester(十五碳酸甲酯)18231820-0.0986C18H36OHexahydrofarnesylacetone(植酮)184718440.280.3787C16H22O4Diisobutylphthalate(邻苯二甲酸二异丁酯)187718700.39-88C17H32O2Methylhexadec-9-enoate(甲基十六碳-9-烯酸酯)190719049.4218.61

(续表1)

No.FormulaComponentRetentionindexRelativecontent(%)RIexpRIlit[22]HS-SPMESD89C17H32O2(11Z)-11-Hexadecenoicacid,methylester((11Z)-11-十六碳烯酸甲酯)19101913-0.1190C17H34O2Hexadecanoicacid,methylester(棕榈酸甲酯)192819265.9616.2191C16H30O2Palmitoleicacid(棕榈油酸)19441951-0.7092C16H22O4Dibutylphthalate(邻苯二甲酸二丁酯)19491965-0.2093C18H34O2Ethyl9-hexadecenoate(9-十六碳烯酸乙酯)197519770.967.6494C18H36O2Hexadecanoicacid,ethylester(十六酸乙酯)199619930.584.0995C20H30Dehydroabietane(脱氢松香烷)20512054-0.0796C21H42Heneicosene(二十一碳烯)20772089-0.0897C19H34O2Linoleicacid,methylester(亚油酸甲酯)209820923.1213.4198C19H36O29-Octadecenoicacid(Z)-,methylester((Z)-9-十八烯酸甲酯)210421033.1112.7899C19H36O213-Octadecenoicacid,methylester(13-十八碳烯酸甲酯)21022098-2.95100C19H36O211-Octadecenoicacid,methylester(11-十八碳烯酸甲酯)210921150.91-101C19H38O2Methylstearate(硬脂酸甲酯)21242128-1.11102C20H40O2Hexadecanoicacid,2-methylpropylester(十六酸2-甲基丙酯)21422135-0.11103C20H36O2Linoleicacidethylester(亚油酸乙酯)21562162-2.40104C20H38O2Ethyloleate(油酸乙酯)21632173-2.19105C20H38O2(E)-9-Octadecenoicacidethylester(反油酸乙酯)21702174-0.42106C20H40O2Octadecanoicacid,ethylester(硬脂酸乙酯)21912195-0.14107C21H40O2Pentylpalmitioleate(棕榈油酸戊酯)22202226-0.24108C21H42O2Hexadecanoicacid,pentylester(棕榈酸戊酯)2243--0.16109C23H46(Z)-9-Tricosene(顺式-9-二十三烯)22712278-3.91110C20H42O1-Eicosanol(1-二十醇)227222810.31-111C22H42O4Hexanedioicacid,bis(2-ethylhexyl)ester(己二酸二(2-乙基己基)酯)240323980.44-112C22H46OBehenicalcohol(二十二醇)24722470-0.42

-：no detected

2.4 HS-SPME法与SD法提取挥发性组分比较分析

将HS-SPME法和SD法提取的沙棘挥发性成分结果进行比较(表1)。结果发现，2种方法共鉴定出112种化合物，20种共同组分(庚醛、2-正戊基呋喃、柠檬烯、苯乙醛、芳樟醇氧化物、反式-呋喃芳樟醇氧化物、樟脑、藏花醛、1,2-二氢-1,1,6-三甲基萘、α-紫罗酮、α-姜黄烯、十五醛、肉豆蔻酸甲酯、植酮 、甲基十六碳-9-烯酸酯、棕榈酸甲酯、9-十六碳烯酸乙酯、十六酸乙酯、亚油酸甲酯、(Z)-9-十八烯酸甲酯)，脂肪酸酯类和醛类化合物是沙棘挥发油的主要成分，分别占各自挥发性组分总量的33.09%(HS-SPME法)和74.90%(SD法)。在SD法中检测到的相对含量超过10%的棕榈酸甲酯、甲基十六碳-9-烯酸酯、亚油酸甲酯、(Z)-9-十八烯酸甲酯在HS-SPME法中的含量均超过3%，但是SD法中含量较高的9-十六碳烯酸乙酯(7.64%)和十六酸乙酯(4.09%)在HS-SPME法中的含量均不到1%。此外，HS-SPME法萃取物中醛类、酮类、烯烃类、醇类等化合物的种类及含量均高于SD法，如在HS-SPME法中含量较高的壬醛(9.40%)和糠醛(7.24%)在SD法中均未检出。

根据以上分析可知，HS-SPME法和SD法提取的沙棘挥发性组分的种类及含量差异较大。HS-SPME法因萃取温度较低，富集效果强，加热时间短等特点，萃取的化合物种类较多，物质组成比较均衡，更偏向于低沸点的醛类、酮类、萜烯类等化合物。而SD法提取过程中样品浸泡和提取时间较长，加热温度高，可能使含量较低的组分损失，也易造成沸点低、挥发性强的组分流失[21]，所以提取的组分更倾向于高沸点的脂肪酸酯类化合物。因此，将两种提取方法结合能够获得更加全面的沙棘挥发油信息，或者根据研究目的和用途选择合适的前处理方法。

3 结 论

本研究优化了HS-SPME法萃取沙棘挥发性成分的实验条件，并结合气相色谱-质谱鉴定出76种挥发性组分。此外，研究还比较了HS-SPME法和SD法提取物的共性和差异，结果显示，两种方法提取的组分种类及含量差异较大，共鉴定出112种化合物，有20种共同组分，且酯类在两种方法提取物中含量均较高。通过对比2种方法的提取化合物得出，HS-SPME法适合提取低沸点、易挥发的醛类、萜烯类等化合物，SD法更适合提取脂肪酸酯类等沸点较高的化合物。因此，结合2种方法共同分析沙棘的挥发性成分能够得到更加全面的信息。本研究为沙棘挥发油的进一步研究奠定了基础，为沙棘的快速检测、真伪鉴定提供了技术保障。