选择性加速溶剂萃取法结合超高效液相色谱-串联质谱测定杭白菊中19种三唑类杀菌剂

2019-06-21吴慧珍李晓丹汪建妹王向军吉小凤钱鸣蓉

分析测试学报 2019年6期

吴慧珍，李晓丹，汪建妹，王向军，杨华，徐杰，吉小凤，钱鸣蓉*

(1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015；2.浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江杭州 311300；3.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州 310021)

杭白菊(Chrysanthemummorifolium)为菊科多年生草本植物，药食同源道地药材，主产于浙江嘉兴桐乡、海宁等地，具有健胃通气、平肝明目和清热解毒之功效[1]，亦常用作饮品。在杭白菊的栽培过程中常施用杀菌剂等多类农药，以防治花叶病、叶枯病、根腐病、病毒病等病虫害，故可能产生农药残留。台北市卫生局对干菊花的抽样调查显示，近9成以上的干菊花存在农药残留问题[2]。赵维良等[3]对28批菊花样品中12种农药进行检测，发现多菌灵、毒死蜱的检出率较高。方翠芬等[4]根据菊花产地和加工方法不同，对10批样品中13种农药进行检测，其中三唑磷含量达0.492 mg/kg，超过限量近5倍。因此，为控制杭白菊的质量，对其进行农药残留分析十分必要。

三唑类杀菌剂作为一种高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，广泛用于水果、蔬菜、中药材等的病害防治。在药材种植及加工、贮存等过程中过量或不当施用农药，均可能产生药物残留，造成药材污染[5]。我国对于药材中农残检测技术和监测标准起步较晚，现行的GB 2762-2017《食品中污染物限量》及GB2763-2016《食品中农药最大残留限量》标准中均无杭白菊中的农药残留指标[6-7]。关于菊花中农药残留检测主要集中于有机氯、菊酯类等杀虫剂，较少涉及杀菌剂[8]。目前三唑类杀菌剂检测的常用前处理技术有固相萃取(SPE)、QuEChERS法、分子印迹固相萃取(MISPE)、加速溶剂萃取(ASE)等，检测方法主要为气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等[9-11]。但现有的前处理技术实验步骤繁琐，费时费力。

随着技术的发展，简单高效的前处理技术结合大型仪器精准测定是残留检测的发展趋势[12-14]。加速溶剂萃取法(ASE)具有溶剂用量少、操作自动化、提取充分、速度快等优点，已选为美国环保局推荐标准方法(EPA3545)，广泛应用于环境、食品、药物等领域的样品前处理，在农药方面的应用尤为突出[15-17]。选择性加速溶剂萃取法是在ASE的萃取池中同时装填样品和吸附剂，在样品提取过程中，杂质被分散吸附剂所吸附，提取液中只存在目标物，样品的提取与净化在同一步中完成，有效减少了实验步骤。本文采用选择性加速溶剂萃取法结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)建立了简便、快速和准确的杭白菊中19种三唑类杀菌剂的同时测定方法，并成功应用于市售杭白菊样品中三唑类杀菌剂的检测，为菊花产品中杀菌剂的有效监测提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC 30AD超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，6500 QTRAP质谱仪(美国Applied Biosystems公司)，配备Multiquant 3.0数据处理软件；BS 2202S型电子天平(感量为0.01 g，德国Sartorius公司);Turbovap®LV浓缩仪(瑞典Biotage公司)；草药粉碎机(荷兰Philips公司)；ASE 350型加速溶剂萃取仪，配置34 mL萃取池(美国Thermo Scientific公司)。

甲醇和乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸(色谱纯，西班牙Scharlau公司)；乙酸乙酯(分析纯，华东医药股份有限公司)。吸附剂：N-丙基乙二胺(PSA，40～60 μm)、C18(40～60 μm)、石墨化碳(GCB，120～400目)均购于Agela Technologies公司。硅藻土(80～100目)购于美国Thermo Scientific公司。实验用水为超纯水，采用美国Millipore净化装置自制。三唑类杀菌剂标准品(纯度均≥95%)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

将待测杀菌剂标准品溶于甲醇中，配成质量浓度为100～300 mg/L的储备液，将储备液用甲醇水(1∶1,体积比)稀释配成5 mg/L的混合标准中间液。用空白样品提取液配制不同质量浓度的基质匹配标准工作溶液，于-4 ℃保存，现用现配。

1.2 样品处理

1.2.1 样品制备市购同一批次干燥杭白菊，经草药粉碎机充分粉碎，过50目筛后保存于真空袋中，置干燥处备用。

图1 加速溶剂萃取池内样品和吸附剂装填示意图Fig.1 Schematic diagram of sample and adsorbent loading in accelerated solvent extraction tank

1.2.2 加速溶剂萃取过程在34 mL不锈钢萃取池内，从下至上依次将滤纸、3 g硅藻土、2 g净化吸附剂(PAS+C18+GCB)、1 g药材和2 g硅藻土装填至萃取池内(图1)。萃取溶剂为乙腈；萃取压力为6.9 MPa；萃取温度为90 ℃；加热时间为5 min；静态萃取时间为10 min；萃取循环次数为1次；冲洗体积为40%；氮气吹扫时间为90 s。提取完成后，将萃取液置于Turbovap®LV浓缩仪中氮气吹干。残渣用5 mL甲醇水(1∶1)复溶，取1 mL复溶液至1.5 mL离心管，以10 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待仪器分析。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters公司)；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流动相：A为2 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)，B为甲醇，梯度洗脱程序：0～1 min，70% A，1～1.1 min，70%～40% A，1.1～3 min，40% A，3～8 min，40%～10% A，8～12 min，10% A，12～12.1 min，10%～70% A，12.1～15 min，70% A。

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5.0 kV；雾化气和辅助气(氮气)压力：345 kPa：气帘气(氮气)压力：276 kPa；离子源温度：500 ℃。三唑类杀菌剂的MRM参数见表1。

*quantitative ion pair;bromuconazole,cyproconazol and difenoconazole are based on the sum of the peak areas of the two isomers(定量离子对；糠菌唑、环唑醇和苯醚甲环唑以两个异构体的峰面积之和计)

2 结果与讨论

2.1 选择性加速溶剂萃取条件的优化

2.1.1 萃取溶剂与吸附剂的选择在参考文献[17-18]基础上，比较了乙腈(ACN)、1%乙酸乙腈(AA)、乙酸乙酯(EAC) 3种萃取溶剂在不同吸附剂净化条件下对目标化合物回收率的影响。由于菊花主要含有黄酮类、挥发油和氨基酸等小分子化合物以及色素等大分子化合物[8]，为除去杂质干扰，减少基质效应，选择不同吸附剂组合进行净化。吸附剂组合为：PSA、C18、GCB、PSA+GCB(1∶1)、C18+GCB(1∶1)、PSA+C18(1∶1)和PSA+C18+GCB(1∶1∶1)。其中，PSA的极性选择范围较广，能够吸附脂肪酸、有机酸、极性色素及糖；C18适合吸附非极性或弱极性的物质；GCB去除色素效果较好，但过量使用可能对目标化合物产生吸附[19-20]。在加标50 μg/kg的空白杭白菊样品中，比较了上述萃取溶剂和吸附剂(用量均为1.0 g)对目标化合物的提取效率及净化效果。结果显示，在萃取温度60 ℃，萃取压力276 kPa，静态萃取5 min，萃取循环3次的条件下，以乙酸乙酯为萃取溶剂时，采用上述7种吸附剂净化对目标化合物的萃取效率均较低(图2)，可能由于乙酸乙酯的渗透性差，无法对目标物进行有效提取。而乙腈的提取效果相对较好，这可能是由于乙腈的极性较强，不仅可减少色素和糖分等杂质的溶出，且能够保证较好的提取效率[21]。

由图2可知，采用上述3种萃取溶剂时，单独使用PSA、C18和GCB吸附剂净化得到的目标化合物回收率集中在60%～70%，而组合使用吸附剂的回收率优于单一吸附剂，19种杀菌剂的回收率集中在60%～80%，因此采用组合吸附剂。当以乙腈为萃取溶剂时，使用4种吸附剂组合得到的回收率接近，均高于以1%乙酸乙腈和乙酸乙酯为萃取溶剂时的回收率，但以PSA+GCB(1∶1)和C18+GCB(1∶1)为吸附剂时部分目标化合物的回收率小于70%(图2)。而使用PSA+C18(1∶1)和PSA+C18+GCB(1∶1∶1)得到的回收率差异不明显，均在70.8%～84.8%之间。由于添加适量GCB能有效去除色素，可得到澄清萃取溶液，因此最终选择乙腈为萃取溶剂，PSA+C18+GCB(1∶1∶1)为吸附剂。

图2 不同萃取溶剂和吸附剂对三唑类杀菌剂回收率的影响Fig.2 Effects of different extraction solvents and adsorbents on recoveries of triazole fungicidesACN;AA;EAC

2.1.2 吸附剂用量的优化考察了吸附剂用量(0.5、1.0、2.0、3.0 g)对目标化合物回收率的影响。结果表明，当吸附剂用量为0.5 g和1.0 g时，19种杀菌剂的回收率为59.5%～84.8%，而吸附剂用量为2.0 g时回收率增至78.6%～91.6%。继续增加吸附剂用量时回收率无明显提升，且烯效唑、戊菌唑等的回收率降低，这可能是由于吸附剂对目标物也产生了一定吸附作用，因此选择最佳吸附剂用量为2.0 g。

表2 正交实验设计及实验结果Table 2 Orthogonal experimental design and results

A.extraction temperature;B.static extraction time;C.extraction times

2.2 基质效应

基质效应是由于提取液中基质和待测物共存而导致待测组分在仪器中响应信号有不同程度的抑制或增强，是复杂基质的常见现象。将空白杭白菊样品按优化方法处理后配制成基质匹配标准溶液，同时用甲醇水(1∶1)配制相同浓度的溶剂标准溶液。按下式计算基质效应(C%)：C%=(1-Ss/Sm)×100，其中Ss为基质匹配标准曲线的斜率，Sm为溶剂标准曲线的斜率。当结果为正表示基质抑制，为负则表示基质增强[23]。平均基质效应(增强或抑制)超过20%时，则表明基质效应对定量检测具有显著影响[24]。结果表明杭白菊中的基质效应为32%～42%，显示存在基质抑制。因此采用基质匹配标准曲线定量，以减少基质对检测结果的影响。

2.3 方法验证

2.3.1 线性关系、检出限与定量下限在优化条件下，19种三唑类杀菌剂可获得较好的分离，图3为空白杭白菊样品中加标10 μg/kg的定量离子色谱图。以空白样品提取液添加不同质量浓度(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L)的混合标准溶液，在优化实验条件下测定，结果表明，19种三唑类杀菌剂在1.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)≥0.99；在10 μg/kg加标水平下，根据3倍和10倍信噪比分别确定该方法的检出限(LOD)为0.6～3.0 μg/kg，定量下限(LOQ)为2.1～10.0 μg/kg(见表3)。

2.3.2 回收率与相对标准偏差将空白杭白菊样品按本方法处理，分别在10、50、100 μg/kg水平下进行加标实验，每个水平重复测定5次。结果显示，19种三唑类杀菌剂的平均回收率为70.3%～95.3%，相对标准偏差(RSD)为0.60%～12%(见表3)。

2.4 实际样品分析

选取当地超市和市场10批杭白菊样品，采用本方法进行检测。由表4可知，共检出6种三唑类杀菌剂，检出量为0.58～86.3 μg/kg，其中检出率最高的为苯醚甲环唑、三唑酮、戊唑醇和烯唑醇，粉唑醇、氟环唑分别有1例和2例检出。我国目前对菊花中三唑类杀菌剂尚无限量标准，鉴于菊花被广泛用作花茶，参照日本“肯定列表制度”规定，11种三唑类杀菌剂在茶叶中的最大残留限量为0.1～50 mg/kg[25]，本实验检出的6种三唑类杀菌剂均未超过限量标准。

图3 空白杭白菊中19种三唑类杀菌剂的定量离子色谱图(加标10 μg/kg)Fig.3 Quantitative ion chromatograms of 19 triazole fungicides in blank Chrysanthemum morifolium(spiked 10 μg/kg)

CompoundLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)Spiked10μg/kgSpiked50μg/kgSpiked100μg/kgRecovery/%RSD/%Recovery/%RSD/%Recovery/%RSD/%Flutriafol2.06.683.31183.21.778.44.6Triadimefon2.89.388.62.992.01.283.51.9Myclobutanil1.03.380.26.383.72.482.10.90Bromuconazole0.82.680.69.383.71.579.22.2Triadimenol3.010.086.11282.42.588.23.0Cyproconazole2.99.780.65.882.72.182.21.9Triticonazole3.010.076.17.470.32.078.04.5Epoxiconazole0.72.375.50.6074.27.178.68.1Tetraconazole0.62.184.45.278.33.781.61.7Simeconazole1.96.386.33.884.31.982.71.9Fenbuconazole1.65.272.75.178.65.984.74.7Flusilazole0.72.285.68.582.03.383.93.2Uniconazole1.96.574.84.577.13.882.35.4Penconazole1.34.378.54.377.92.082.62.5Tebuconazole0.82.885.06.789.32.892.62.4Propiconazole2.17.079.35.995.31.286.92.1Hexaconazole2.89.379.78.087.92.480.43.7Difenoconazole1.96.283.21190.35.282.73.2Diniconazole3.010.081.82.383.74.887.78.0

3 结论

本文建立了选择性加速溶剂萃取结合UPLC-MS/MS同时测定杭白菊中19种三唑类杀菌剂的方法。样品采用乙腈提取，PSA、C18和GCB组合吸附剂同步净化，经色谱分离后进行质谱检测。采用该方法对市售10个杭白菊样品进行检测，共检出6种三唑类杀菌剂，检出量为0.58～86.3 μg/kg。与传统的加速溶剂萃取法相比，选择性加速溶剂萃取将样品的提取和净化同步完成，简单、快速，自动化程度高，可用于中药材中多残留的痕量检测。