子体铅诱导T30695构象改变N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)荧光探针检测氡

刘红文,刘士蒙,李诗雅,杨桂英,刘 然,吕昌银

(南华大学 公共卫生学院，湖南 衡阳 421000)

氡是238U、235U和232Th等放射性核素的衰变产物，无色无味，易溶于水，半衰期为3.82天，其衰变产生的子体210Pb的半衰期长达21年[1-3]。氡是室内放射性气体污染物的主要存在形式，人类所遭受的自然辐射剂量中有一半来自氡的辐射。氡及其衰变子体形成的气溶胶被人体吸入后，可蓄积在人体肺细胞组织和骨骼中，衰变过程产生的α粒子将会破坏细胞核中的 DNA分子，造成人体呼吸系统、血液系统疾病和细胞遗传学损伤[4-5]。氡及其子体已经成为引发肺癌、白血病、皮肤病以及其他呼吸道疾病的重要元凶[6]。现代人约有80%的时间在室内度过，氡污染引起的人体健康问题受到越来越多的关注。因此监测环境中氡的浓度对保障人类健康具有重要意义。

传统的放射性气体氡的检测方法，多是基于核科学和物理学领域中针对氡辐射产生的α射线等来测定氡累积浓度的物理检测方法。近年来，核酸适配体因其高效特异的结合能力，无毒性、易合成、稳定性好等优点，已成为重金属检测领域的研究热点[7]。Wang等[8]筛选出可与Cd2+作用并产生二级结构构象变化的核酸适配体，并基于此构建了一种可检测低浓度Cd2+的生物传感器。Zhu等[9]设计了一种银特异性的核酸适配体，可与低浓度的Ag+形成G-四链体结构，并产生荧光猝灭作用，实现对低浓度Ag+的定量检测。Chen等[10]经过18次的阳性和阴性选择，获得了两种具有高度结合性和特异性的核酸适配体，并据此设计了荧光生物传感器用于Pb2+检测。

1998年Arthanari等报道了一种不对称的阴离子活性卟啉荧光染料—N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(N-methyl mesoporphyrin Ⅸ，NMM)，其最大吸收波长约为399 nm，最强发射峰波长在610 nm左右。NMM自身的荧光强度很弱，很难与单链DNA、双螺旋结构的DNA结合，但可与G-四链体结构产生特异性结合，结合后体系荧光强度明显增强[11]。作为G-四链体的荧光染料，NMM已经在生物分析技术领域得到了广泛地应用。本文根据氡辐射衰变的特点，结合铅离子的现代分析新技术，以NMM作为荧光探针，探讨了Pb2+诱导富G序列形成G-四链体的特性，建立了一种基于Pb2+诱导富含鸟嘌呤的寡核苷酸链T30695构象改变的荧光传感器对铅和氡进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；J-815圆二色谱光谱仪(日本Jasco公司)；RAD7 Electronic radon detector(美国Durridgce公司)；氡室(南华大学核工业第六研究所)；混合纤维素膜(Merck Milipore公司)。

冰醋酸(HAc，天津市福晨化学试剂厂)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；铅标准溶液(100.0 μg/mL，中国计量科学院)；富含鸟嘌呤的寡核苷酸链T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)与互补链C-T30695(5’-ACCCACCCACCCACCC-3’)(上海生工生物工程股份有限公司)；荧光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM,百灵威公司)；实验用水为灭菌超纯水(电阻率为18.25 MΩ·cm)。

1.2 氡样本的采样方法

以10 mL 0.2%(体积分数)醋酸为吸收液，以直径70 mm，高17 mm的一次性塑料培养皿为收集器，在平皿口加封混合纤维素膜(孔径为0.8 μm)；设定采样时间，将采样器放入氡室，被动式采集含铅样本。采样后密封,室温放置4 d，用0.2%的醋酸定容至10 mL，混匀，4 ℃冰箱保存，待测[12-14]。

1.3 Pb2+标准溶液的紫外光谱测定

将T30695及C-T30695分别配制成1 μmol/L的工作溶液，于95 ℃的金属恒温仪中加热5 min，置于空气中迅速冷却至室温，备用。在反应管中，依次加入100 mmol/L Tris-HAC缓冲溶液(pH 7.25)50 μL，1 μmol/L T30695溶液20 μL，以及一定量的铅标准溶液，混匀，于室温孵育80 min。

加入1 μmol/L的C-T30695溶液20 μL，于室温下孵育15 min后，加入NMM染料(1.72×10-5mol/L) 50 μL，加超纯水至200 μL，混匀，室温下避光孵育10 min后待测。设置仪器的激发波长为399 nm，发射波长为610 nm，测定各管的荧光强度值(IF)，以超纯水作空白测定荧光值(IF0)，计算ΔIF=IF0-IF，建立荧光强度差(ΔIF)对铅离子浓度(c)的线性回归方程。

2 结果与讨论

2.1 荧光传感原理

氡衰变形成稳定的子体铅只需约3.82 d，且衰变产生的子体铅210Pb非常稳定。本实验以子体铅作为目标检测物，建立了氡的免标记荧光DNA传感器生物分析新方法。用含0.2%醋酸吸收液的采样皿进行被动式采样，氡进入采样皿后，衰变产生子体铅，随后在稀醋酸中转变形成铅离子。

实验原理如图1所示。NMM单独存在时荧光很弱，在没有Pb2+存在的条件下，富鸟嘌呤DNA单链T30695与互补链C-T30695结合形成双链结构，不能与NMM结合，NMM游离在溶液中，体系产生弱荧光；当体系中导入Pb2+时，Pb2+诱导富G单链T30695发生构型转变，形成G-四链体结构，荧光染料NMM嵌入G-四链体结构中，产生强的荧光。在一定浓度范围内，两体系荧光信号差值ΔIF与Pb2+浓度呈线性关系。据此，建立了基于铅诱导T30695构象改变的荧光法检测铅和氡。

图1 基于Pb2+诱导特异性核酸适配体构象转变的非标记荧光法测氡原理图Fig.1 Schematic diagram of radon label-free fluorescent detection based on structure exchange of aptamer

2.2 实验机制可行性分析

文献[15]报道，NMM与双链DNA的结合能力较低，但能很好地与阳离子诱导形成的稳定G-四链体结合，发出较强的荧光。为验证荧光传感原理的正确性，进行了机制验证实验。结果如图2所示，当体系中只存在NMM时，设定激发波长为399 nm，测定NMM在560～700 nm处的荧光强度，结果发现体系的荧光强度IF≤400(曲线a)，说明NMM本身的荧光较弱。

图2 不同实验体系NMM染料的荧光发射光谱图Fig.2 Fluorescence emission spectra of NMM in different systems cNMM=4.30 mmol/L,cT30695=cC-T30695=cPb2+=100 nmol/L

当向富含鸟嘌呤的DNA单链T30695溶液中加入富含胞嘧啶的DNA互补链C-T30695后，通过碱基互补配对，T30695与其互补链结合成为双链，形成双螺旋结构。由于NMM不能与DNA双螺旋结构结合，使得“NMM+T30695+C-T30695”体系测定的荧光强度比较微弱(曲线b)，与“NMM”体系荧光强度相差不大。该实验结果证明NMM与双链DNA的结合能力弱，产生的荧光也很弱。

当体系中同时存在Pb2+与核酸适配体T30695，进行一段时间孵育后，T30695被Pb2+诱导形成G-四链体结构。此时，加入荧光染料NMM可与G-四链体结构的核苷酸链结合，体系的荧光强度显著增强，如图2曲线d所示，“NMM+Pb2++T30695”体系的荧光强度IF≈1 100，且Pb2+离子浓度越大，体系荧光强度增强越多。该实验结果说明NMM与G-四链体结构有较好的结合能力，从而产生较强荧光。

当核酸适配体T30695被Pb2+诱导形成G-四链体结构后，再加入互补链 C-T30695，二者很难再形成DNA双螺旋结构。NMM仍可与G-四链体结构结合发出较强荧光，如图2中曲线c所示，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”体系的荧光强度IF≈800，仍然比“NMM+T30695+C-T30695”体系的荧光强度强，且两者间荧光强度的变化随着Pb2+离子浓度的增大而增大。该实验结果说明Pb2+诱导T30695形成了G-四链体结构，与NMM结合产生了较强荧光。

图3 圆二色光谱图Fig.3 Circular dichroism spectracT30695=cC-T30695=cPb2+=100 nmol/L

与“NMM+Pb2++T30695”体系相比，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”体系的荧光强度并没有达到与之相同的水平。这可能因为体系中存在C-T30695和Pb2+竞争结合T30695，导致仍有少量DNA双螺旋结构形成，该双螺旋结构未与NMM结合产生荧光。因此，荧光强度略低于NMM与G-四链体结合时的水平[16-17]。

2.3 圆二色谱实验

为进一步探究荧光强度变化与核酸适配体T30695构象改变间的关系，从分子结构的角度，更好地说明Pb2+诱导T30695发生的构象变化，进行了圆二色谱验证实验，结果如图3所示。核酸适配体T30695单链状态下在265 nm处有一个正峰(曲线a)，加入Pb2+诱导T30695形成G-四链体结构后，在265 nm处的正峰显著升高，并于245 nm处出现了一个负峰(曲线b)，这一结果符合顺式平行结构G-四链体的特征[18]。单独将T30695与互补链C-T30695孵育一段时间后，在260～285 nm处扫描出正峰，在240 nm左右处扫描出一个明显的负峰(曲线d)，这一结果符合较典型的多聚鸟嘌呤与胞嘧啶寡核苷酸链形成B型双螺旋结构的圆二色光谱图特征[16,19]，证明T30695与C-T30695结合形成了B型双螺旋结构。核酸适配体T30695与Pb2+孵育一段时间后，再加入互补链C-T30695，扫描得到一个不是很典型的圆二色光谱图，245 nm处有一个负峰，265～285 nm处出现了一个较大的正峰(曲线c)，可能是因为这一体系中同时存在G-四链体结构和B型双螺旋结构，因此在245 nm处有负峰，265 nm和285 nm均有正峰[16]。

2.4 实验条件优化

在pH 6.5～8.0的酸度范围内对pH值的影响进行了研究。结果显示，酸度对ΔIF值影响较大。pH 6.75～7.25时，ΔIF值逐渐上升；pH 7.25～8.00时，ΔIF值逐渐下降，所以，实验选择pH 7.25的Tris-HAc缓冲液维持体系的酸碱性。同时考察了Tris-HAc用量对检测性能的影响，随着Tris-HAc用量的增加，荧光差值ΔIF逐渐增高，在45 μL左右达到平台，45～70 μL体积范围内，荧光差值ΔIF趋于稳定。因此，实验选择加入50 μL的Tris-HAc缓冲溶液进行后续研究。

对反应体系中Pb2+与T30695的孵育时间进行研究，结果显示，75 min之前ΔIF值逐渐增大，说明随着反应时间的增加，形成G-四链体的量增加，其与NMM染料结合后，荧光强度(IF)增强，导致荧光差值(ΔIF)也逐渐增加。75 min以后，Pb2+离子已经与之完全结合，ΔIF值的变化趋于平缓。据此，选择孵育时间为80 min。同时考察了C-T30695孵育时间对实验体系的影响，根据实验结果，选择15 min作为互补链C-T30695的孵育时间。

图4 共存物质对测定体系的影响Fig.4 Responses of the Pb2+ sensors over other competing metal ions concentration：50 nmol/L for Pb2+,5 μmol/L for Bi3+, 2.5 μmol/L for Mn2+,Cr3+,Zn2+

荧光染料NMM的反应时间与浓度对测定结果有一定影响。实验发现，加入NMM染料前5 min，体系的荧光差值(ΔIF)变化非常大，5 min后，ΔIF的变化趋于平缓，说明此时NMM与G-四链体结合已基本完成并发出较强荧光。10 min后体系荧光差值有稍许下降，但变化趋于平缓，可能的原因是，体系中的C-T30695与部分T30695结合，导致荧光差值些许下降，但随着时间的增长，体系达到稳定状态，荧光差值变化趋于平缓。因此，实验选择10 min作为NMM染料的反应时间。通过考察荧光染料NMM浓度的影响，选择NMM的反应浓度为4.30×10-6mol/L。

2.5 共存干扰物的影响

图5 氡累积浓度与荧光强度的关系Fig.5 Correlation curve of fluorescence intensity and radon concentration

2.6 标准曲线与检出限

按实验方法操作，测定Pb2+离子标准系列溶液的荧光值IF和未加Pb2+离子的试剂空白溶液的荧光值IF0,计算ΔIF值，绘制标准曲线。 Pb2+浓度在5.13×10-9～1.25×10-7mol/L范围内与体系的ΔIF值呈现良好的线性关系，回归方程为ΔIF=77.30+5.05cPb(10-9mol/L)，相关系数r=0.995 0。对空白溶液平行测定11次，计算空白溶液的标准偏差为sb=2.59，按照CL=3sb/k计算得到铅离子的检出限为1.54×10-9mol/L。

2.7 氡累积浓度的测定与模型建立

按照采样方法，在南华大学核六所氡实验室采集累积浓度分别为0.96、1.95、5.86、11.66、17.42、20.31、23.19(×104Bq·h/m3)的氡辐射样品溶液，如表1所示，随着氡累积浓度的增加，铅含量和样品的荧光差值ΔIF值(图5)也逐渐增加。进一步分析图5发现，在0.96～23.19×104Bq·h/m3的氡浓度范围内，荧光差值ΔIF与氡累积浓度之间呈对数增长的关系，符合放射性物质指数衰变的特性;但在3.58×104～16.92×104Bq·h/m3氡浓度范围内，两者之间存在良好的线性关系：ΔIF=3.60cRn+140.27，r=0.994 9。本方法氡的检测范围为3.58×104～16.92×104Bq·h/m3，检出限为1.07×104Bq·h/m3。对样品溶液平行测定6次，相对标准偏差(RSD)为1.7%～3.3%，加标回收率为96.0%～104%，表明方法测定干扰小，结果准确可靠，适用于铅离子和氡积累浓度的检测。

表1 样品中Pb2+离子的检测结果(n=6)Table 1 Determination results of Pb2+ in the samples(n=6)

‘Found’ and ‘Added’ refer to the final concentration

3 结 论

本文以氡辐射的子体铅为目标检测物，应用核酸适体构建了一种免标记高灵敏的荧光DNA传感器，并实现了铅浓度和氡辐射剂量的生物分析化学测定。方法仪器设备简单，操作简单快速，样品几乎无干扰，具有较高的灵敏度，对铅的检出限为1.54×10-9mol/L，对氡的检出限1.07×104Bq·h/m3。本法避免了现场进行氡辐射剂量测量的放射性危害，开拓了核酸适配体对无机物、气体和放射性物质的生物分析新领域。