基于MALDI-TOF MS微生物检测的一次性纸基靶板开发

曾 真，喻佳俊，刘 平，黄正旭，高 伟，李 梅，周 振，李 磊*

(1.暨南大学 质谱仪器与大气环境研究所，广东 广州 510632；2.广州禾信康源医疗科技有限公司，广东 广州 510530)

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种生物质谱[1]，该技术通过检测微生物的蛋白质指纹图谱来鉴定微生物[2-5]，具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等特点[6]，现已广泛应用于医学诊断、生物防御、环境监测和食品质量控制等领域。

靶板用来承载待检测的样品和基质，是MALDI-TOF MS的重要组成部分。靶板的使用材料以及制作工艺对质谱仪的性能有很大影响，目前市面上所用的靶板主要为可重复使用的不锈钢靶板。临床诊断对医疗器械和用具的清洁程度有很高的要求[7]，例如尿检、血检等使用的都是一次性可丢弃的塑料管，非一次性的用具在使用之前也有一系列的消毒规范[8]。一方面要避免残留物影响检测结果，另一方面也要给患者和医护人员提供安全良好的医疗环境，避免病源的交叉感染[9]。不锈钢靶板最主要的缺点就是每次使用完均需使用丙酮等有机溶液清洗[10]，过程繁琐且易有残留，不仅耗费大量时间，稍有不慎还会影响诊断的结果。可抛弃的一次性靶板是临床应用的发展方向，Schurenberg 等[11]提出的一种一次性塑料靶板获得了较为广泛的应用，但塑料材料难降解，使用完后仍不易处理，若将带有致病菌的塑料靶板随意丢弃，会对土壤或水环境造成一定的污染[12]。近年来，基于纸开展的科学研究工作越来越多，Whitesides等[13]首次提出将纸作为微流控技术芯片，代替常规的玻璃、硅、石英、高聚物等材料，使微流控芯片的成本降低并可作为一次性分析器件使用。Wang等[14]第一次将纸应用于质谱领域作为电喷雾电离源的基质和载体，被称为纸喷雾电离技术。该技术具有快速、低廉、高效等特点，已被用于血样、尿样、食品、生物组织样品、藻类等样品的快速分析检测[15-18]。鉴于此，本团队开发了一种用于MALDI-TOF MS的纸基靶板。该靶板相比于普通钢靶板的优点在于：(1)成本低且便于携带和运输；(2)使用完后可以直接更换，节省了清洗所耗费的时间；(3)一次性使用，可以避免之前的残留物影响检测结果；(4)由于液体在纸上具有扩散性，只需少量的样品就可以扩散整个靶点，使样品的消耗量更少。与普通的塑料一次性靶板相比：(1)纸质靶板制作工艺更加简单，在实验室即可自行制备，随用随制，成本低廉；(2)用后焚毁不会对土壤或水环境造成污染。本文通过对比同种样品在纸基靶板与不锈钢靶板上检测时谱图的分辨率、灵敏度、重现性，证实了纸基靶板能替代常用的钢靶板；实际细菌检测结果表明，该纸基靶板具有用于临床微生物检测的潜力。

1 实验部分

1.1 实验样品

缓激肽1-7(B4181,Bradykinin Fragment 1-7,756.40 Da)、血管紧张素Ⅱ(A8846,Angiotensin Ⅱ,1 045.54 Da)、促肾上腺皮质激素肽段18-39(A8346,ACTH Fragment 18-39,2 464.20 Da)、胰岛素(I6279,Insulint,5 729.61 Da)、细胞色素C(C8857,Cytochrome C,12 361.96 Da)、肌红蛋白(A8971,Apomyoglobin,16 951.30 Da)、牛血清白蛋白(A8471,BSA,66 429 Da)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(C8982,CHCA)、0.1%三氟乙酸(T3443,TFA)、乙腈(A8596,ACN)，均购于Sigma Aldrich公司。

混合多肽校准品Peptide Calibration StandardI(#206195,BrukerDaltonics)和混合蛋白校准品Protein Calibration StandardI(#206355,BrukerDaltonics)均来源于德国布鲁克道尔顿公司；大肠杆菌由北京鑫汇普瑞科技发展有限公司惠赠。所用实验纯净水均由Milli-Q系统产生。

基质CHCA利用乙腈-三氟乙酸-水(50∶2.5∶47.5,体积比)混合溶剂溶解，配成CHCA的饱和溶液。标准蛋白、多肽样品根据所需浓度利用0.1%三氟乙酸溶液配制而成。处理微生物样品时，从培养基上挑选3～4个单菌落，加入300 μL的灭菌纯水和700 μL的无水乙醇混匀，离心后弃去上清液，再次离心，去除残余的上清液，加入70%甲酸水溶液-乙腈(1∶1,体积比)20 μL，充分混匀后离心，取上清液进行实验。所有样品均采用覆盖点样法，即每个点位先点1.0 μL样品，干燥后再覆盖1.0 μL基质，自然风干后上机待用。

1.2 纸靶板的制作

纸基材质因吸水性、孔径、纤维粗细等参数不同而具有不同的特性。本实验选择Whatman No.1滤纸[19]作为制作纸基靶板的材料。此滤纸具有空隙均匀、颗粒保留效果良好等优点，且溶剂的作用会使纤维素膨胀从而减小毛细管作用力，降低甚至阻止液体的渗透和流动，有利于样品的聚集。

图1 纸基靶板实物图Fig.1 The picture of the real paper-based plate

纸基靶板的制作采用手绘蜡印技术[20-22]。具体步骤如下：(1)模具设计：根据所需靶点的尺寸及数量利用不饱和聚酯树脂制作热固性塑料模具，模具上圆点的尺寸和数量均可由用户根据需求自行设计。本实验仪器采用的模具点尺寸与标准96孔靶板一致，孔横纵间距均为4 mm，孔直径为3 mm，模具中圆点部分无孔紧实，圆点周边呈网纱质地，以使蜡能渗透。(2)压模与涂蜡：将上述模具覆盖在滤纸上，用蜡笔将整个模具描满，使模具和滤纸成一整体。(3)压实：用不锈钢片来回压实蜡笔描摹区域，使蜡体稳定地附着在滤纸表面。需特别注意，在来回压实的过程中，需用力重复压实动作10～20次，才能使蜡体较好地附着在滤纸表面。(4)热印：将粘连的模具和滤纸整体放置在高温炉(大约150 ℃)上加热2～3 s，使每个孔位周边区域的蜡渗透至滤纸上，在滤纸上形成孔位亲水和外周疏水的靶板(图1)。

1.3 实验方法

利用蛋白及多肽样品对比纸基靶板与钢靶板的分辨率和灵敏度，并测试纸基靶板的重现性，从而验证纸基靶板使用的可行性。采用10 pmol/μL的激缓肽、血管紧张素Ⅱ、促肾上腺激素肽段18-39、胰岛素、细胞色素C、肌红蛋白、牛血清白蛋白，对比考察纸基靶板与钢靶板在同种实验条件下质谱仪的分辨率情况。分辨率均为5次独立测试结果的平均值。灵敏度则利用10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL的BSA进行对比，计算各浓度下BSA 3个离子峰的信噪比(取5次实验结果的平均值)，BSA的3个离子峰包括母体离子峰(m/z66 430)、双电荷离子峰(m/z33 216)、三电荷离子峰(m/z22 144)。再利用Peptide Calibration StandardI(离子峰质量分布在1 000～4 000 Da之间)检验纸基靶板的重现性，Peptide Calibration StandardI包含血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ,1 295.68 Da)、血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,1 045.54 Da)、物质P(Substance P,1 346.74 Da)、铃蟾肽(Bombesin,1 618.82 Da)、促肾上腺激素1-17(ACTH clip 1-17,2 092.09 Da)、促肾上腺激素18-39(ACTH Clip 18-39,2 464.20 Da)、生长激素抑制素28(Somatostatin 28,3 146.47 Da)7种多肽。最后将纸基靶板实际应用于大肠杆菌的鉴定。

MALDI-TOF MS为实验室自制的直线式基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪[23]。所有谱图均在正离子模式下得到，离子加速电压为22 kV，所用激光波长为343 nm，频率为20 Hz，能量为出峰的临界值。每张谱图为激光出射200次的叠加图谱。使用标准蛋白混合物Protein Calibration StandardI和标准多肽混合物Peptide Calibration StandardI校准质谱仪。微生物鉴定数据库由北京鑫汇普瑞科技发展有限公司提供。

图2 纸基靶板(A)和不锈钢靶板(B)上BSA(10 pmol/μL)与CHCA基质的共结晶图Fig.2 Crystal of BSA(10 pmol/μL) and CHCA matrix on paper-based plate(A) and stainless steel plate(B)

2 结果与讨论

2.1 结晶情况

图2A和图2B分别为纸基靶和钢靶板上1 μL牛血清白蛋白(10 pmol/μL)与1 μL CHCA基质的共结晶图。由图可看出纸基靶板上由于样品与基质的结晶颗粒被纸纤维阻挡不能轻易流动，故结晶范围局限在1 mm内，类似于AnchorChip的靶板效果[24]，可以使仪器具有较高的灵敏度及信号重现性。钢靶板上结晶体稀疏的分布在靶圈内，没有聚集效果，检测时会由于分布不均匀，导致不同区域的信号强度相差较大，重现性较差。

图3 分辨率比较图Fig.3 Comparison of the resolutionA.peptides,B.proteins,C.BSA

2.2 质量分辨率的对比

质量分辨率(以下简称分辨率)对比情况如图3所示。在700～3 000 Da范围内,钢靶板所得的结果优于纸基靶板(图3A)，钢靶板分辨率最高为4 309(m/z2 465)，最低为3 155(m/z757)，纸基靶板分辨率最高为4 128(m/z2 465)，最低为2 484(m/z757)；在3 000～20 000 Da范围内，钢靶板在m/z5 731和m/z12 362的分辨率稍高于纸基靶板，但纸基靶板在m/z8 477和16 952处峰的分辨率优于钢靶板，纸靶板和钢靶板的最低分辨率同时在m/z8 477处出现，分别为746和413，最高分辨率同时在m/z12 362处出现，分别为1 095和1 501(图3B)；20 000～60 000 Da范围内，纸基靶板上m/z22 144、33 216和66 430 3个位置峰的分辨率全部都优于钢靶板，且钢靶板上3个峰分辨率的标准偏差平均值要大于纸基靶板，可以看出钢靶板上峰分辨率的波动比纸基靶板大(图3C)。导致纸基靶板与钢靶板对同一样品分辨率不同的主要原因是同种样品在不同的靶板上结晶情况有差异。当样品形成的结晶小且薄时，样品离子的初始位置分散减小，缩短了分子量相同的离子到达离子检测器的时间差，此时可获得较高的分辨率；但当样品结晶堆积较厚时，样品离子的初始位置分散变大，导致分子量相同的离子到达离子检测器的时间差变大，分辨率变低。但总体上，使用纸基靶板能获得与钢靶板差不多的分辨率。

2.3 灵敏度的对比

图4展示的是10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL的BSA分别在纸基靶板和钢靶板上的谱图。当样品浓度为500 fmol/μL时，BSA的3个峰全部清晰可见，说明两种靶板对于BSA的灵敏度均能达到500 fmol/μL，且纸基靶板上500 fmol/μL BSA在m/z22 144、33 216、66 430位置处峰的信噪比比钢靶板更高(表1)。这是由于纸基靶板的聚焦效果使得样品可聚集在小范围内，从而能获得较高的灵敏度。

2.4 重现性及结晶均匀性验证

重现性结果如图5所示，在纸基靶板上混合多肽Peptide Calibration StandardI 5个靶点的谱图均出现了该混合多肽包含的全部离子峰，表明纸基靶板具有较高的重现性，因此纸基靶板的使用不会对质谱仪的重现性产生影响。为了进一步验证样品与基质结晶在纸基靶板上的均匀性，在激光能量不变的情况下，轰击ACTH样品在同一个靶点上的不同位置，每个位置激光以20 Hz的频率出射80次。图6即为5个位置的ACTH强度变化，由图可知ACTH的峰强度依次为438、404、426、479、457 mV，计算得5个数据间的变异系数值仅为6%；在相同条件下，ACTH在钢靶板上谱图的峰强度分别为1 105、1 054、846、858、928 mV，变异系数为12%，表明纸基靶板上的样品结晶较钢靶板更为均匀。

表1 10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL牛血清白蛋白信噪比Table 1 S/N ratios of 10 pmol/μL,1 pmol/μL，500 fmol/μL BSA

图5 纸基靶板5个不同靶点上Peptide Calibration StandardI的谱图Fig.5 Mass spectra of the five different spots of Peptide Calibration StandardI on paper-based plate

图6 纸基靶板同一靶点上5个不同位置获得的ACTH谱图的峰信号强度Fig.6 Signal intensities of the mass spectra of ACTH in five different shots on paper-based plate

图7 大肠杆菌在纸基靶板上的谱图Fig.7 Mass spectra of the Escherichia coli on the paper-based plate

2.5 微生物检测及质量精度验证

图7为大肠杆菌提取蛋白在纸基靶板上的谱图，将谱图中的主要峰与Jones等[25]在文章中所提的大肠杆菌主要峰的理论峰值相比较，结果如表2所示。除了m/z9 537.9位置处的峰与理论峰值m/z9 535.3偏差为0.3‰外，其余峰值与理论峰值相差均在0.1‰以下。布鲁克MALDI Biotyper细菌鉴定平台的性能指标规定质量精度(外标法)在0.5‰以下即可。分析m/z9 535.3位置处偏差较大的可能原因是：在高质量范围内，受分辨率的限制，质谱仪不能将准分子离子峰与其同位素离子峰完全分开，导致准分子离子峰不是一个呈正态分布的曲线，因此无法确定准分子离子峰的具体质荷比。为解决这一问题需利用软件在原始离子峰的基础上拟合出一个正态分布的曲线，再取其顶点位置的横坐标为峰的质荷比。而当准分子离子峰强度低于同位素离子峰，且强度最大的同位素离子峰处在准分子离子峰偏右的位置时，就会使拟合的平滑曲线顶点向右偏，导致峰的质荷比变大。

表2 纸基靶板上大肠杆菌理论出峰情况与实际出峰情况对比Table 2 Comparison of the theoretical and practical peaks of the Escherichia coli

将质谱数据导入MicroID微生物鉴定系统，鉴定分值9.2分，结果为大肠杆菌(9分以上表示高度可信，8分以上表示结果可信，6～8分表示结果可参考，6分以下表示无鉴定结果或结果不可信)。初步表明纸基靶板可用于微生物的鉴定。

3 结 论

本研究提出了一种用于MALDI-TOF MS分析的新型一次性纸基靶板。该靶板相较于普通钢靶板具有成本低，制作工艺简单，能有效避免样品交叉污染，使用后便于处理，减少环境污染等特点。通过在分辨率、灵敏度、重现性等方面与传统钢靶板进行比较，发现在整体性能上纸基靶板与钢靶板分辨率相当，灵敏度可达到500 fmol/μL(BSA)，且样品检测具有较高的重现性。最后利用纸基靶板以及微生物鉴定系统对大肠杆菌进行分析鉴定，发现纸基靶板所得的谱图与实际大肠杆菌出峰情况基本一致且鉴定结果为高度可信。目前，纸基靶板还在初步测试阶段，后续经过进一步的工艺改进有望在临床微生物的快速诊断等方面发挥积极的作用。