甘肃省天水地区产ESBLs大肠埃希菌致尿路感染的基因分型及耐药性分析*

杨宏斌，张 妍

(天水市中医医院检验科，甘肃天水 741000)

尿路感染又称泌尿系统感染，是由各种病原体入侵泌尿系统引起的疾病，根据有无梗阻、结石、畸形、膀胱输尿管反流等尿路异常情况分为复杂性和非复杂性尿路感染[1]。大肠埃希菌是引起尿路感染的最常见病原菌，国内复杂性尿路感染细菌谱的特点是大肠埃希菌感染比例降低，而产超广谱β内酰胺酶(Extended-spectrump-beta-lactamases，ESBLs)大肠埃希菌菌株比例升高，且各地区产ESBLs大肠埃希菌基因型分布有一定差异[2]。本研究收集2017年1月～2018年10月住院患者尿培养分离的产ESBLs大肠埃希菌1 003株，通过检测ESBLs基因型和药物敏感性试验分析，了解本地区尿路感染产ESBLs大肠埃希菌的耐药基因型流行性及耐药现状，从而为指导临床用药和院内感染的防控提供参考。

1材料与方法

1.1 研究对象 收集我院2017年1月～2018年10月尿路感染患者非重复分离的尿培养大肠埃希菌2 126株，其中产ESBLs大肠埃希菌菌株1 003株。病例入选标准：严格按《尿路感染临床微生物实验室诊断》2016标准要求，选取尿路感染患者中段尿进行培养，菌落计数(CFU)≥105cfu/ml判断为尿路感染病例。

1.2 仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(德国布鲁克公司提供)；ABI7500实时荧光PCR仪(美国ABI公司)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；Taqdna聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；bio-rad电泳仪及凝胶成像系统(美国bio-rad公司)。K-B法药敏纸片购自温州康泰生物公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定及药物敏感性试验：严格按《尿路感染临床微生物实验室诊断》2016标准进行细菌培养和分纯，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)进行鉴定，药物敏感性试验采用K-B法测定各种抗生素的抑菌圈直径。结果根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI 2017)标准判读[3]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。使用WHONET5.6对目的菌株进行药物敏感性分析。

1.3.2 ESBLs表型检测：按照CLSI2017推荐的双纸片协同法进行表型确证试验，即采用头孢噻肟及头孢噻肟/克拉维酸，头孢他啶及头孢他啶/克拉维酸两组纸片进行试验，加克拉维酸比不加克拉维酸抑菌环直径≥5 mm时，判定为产ESBLs菌株。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC70063分别作为ESBLs确证试验的阴性和阳性质控菌株。

1.3.3 ESBLs基因型检测：采用改良碱裂解法[4]提取细菌质粒总DNA，取2 μl提取物作为模板，多重PCR检测blaTEM，blaCTX-M，blaSHV，blaOXA，blaCTX-M-14，bla CTX-M-15和blaCTX-M-3基因型，使用引物序列见表1。反应体系25 μl，ESBLs基因扩增条件：95℃预变性3 min，变性95℃30 s，退火56℃30 s，延伸70℃40 s，32个循环，最后72℃延伸10 min；PCR产物1 g/dl的琼脂糖凝胶电泳后，溴乙啶染色，在紫外线下观察产物片段。

表1 耐药基因引物序列

1.4 统计学分析 采用χ2检验和Fisher确切概率法；药敏试验数据运用WHONET5.6进行处理分析。

2结果

2.1 产ESBLs大肠埃希菌的分布情况 本研究收集尿路感染患者尿培养大肠埃希菌2 126株，经确证试验证实产ESBLs 菌株1 003株，产酶率47.2%。科室分布特点：泌尿外科检出475株，占47.4%，内分泌科(糖尿病患者为主)检出216株，占21.5%，神经外科检出105株，占10.5%，肿瘤科检出81株，占8.1%，妇产科检出69株，占6.9%，急诊科检出55株，占5.5%，其他科室检出2株占0.2%。

2.2 细菌敏感性分析 与非产酶株比较，产ESBLs大肠埃希菌对于青霉素类、1～3代头孢菌素、单环类、氟喹诺酮类、磺胺类的耐药率均超过80%，仅对亚胺培南、美罗培南、磷霉素和呋喃妥因的耐药率小于5%，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；具体药物敏感性分析结果见表2。

表2 产ESBLs大肠埃希菌耐药率分析[n(%)]

注：*示Fisher’s精确概率。

2.3 基因型分布特点 对1 003株产ESBLs大肠埃希菌菌株的耐药基因型检测，结果blaCTX-M基因624株、bla-TEM型287株、bla-SHV型51株、bla-OXA型30株，7株同时携带2种不同耐药基因。部分基因型PCR扩增电泳结果见表3、图1。

2.4 携带不同耐药基因模式与细菌耐药性的分析 1 003株产ESBLs大肠埃希菌携带1种基因型的单一模式624株，同时携带2种不同基因型的复合模式7株。分析复合模式blaCTX-M-14+ bla-TEM型、blaCTX-M-15+ bla-TEM型和blaCTX-M-3+ bla-TEM型对头孢他啶耐药率分别为57.1%(4/7)，28.5%(2/7)和14.2%(1/7)，差异有统计学意义(χ2=10.73，P<0.01)。

表3 产ESBLs大肠埃希菌耐药基因型分布情况

M：Marker；1～2：CTX型；3～4：TEM型；5：SHV型；6：OXA型。

3讨论大肠埃希菌是引起临床各种感染性疾病的重要病原菌，以泌尿系统感染为主，由其入侵尿道导致的尿路感染影响了全球超过1.5亿人口，其高复发率和日趋严重的抗生素抵抗正成为社会公共卫生的重大负担[5]。2017年全国细菌耐药监测网(CARSS)结果调查表明，大肠埃希菌ESBLs产酶率为52.2%，本研究显示，天水地区近2年产酶率为47.2%，略低于全国平均水平[6]，这与国家对抗生素管理的不断加强及临床对细菌耐药性的认识水平提高有关。

尿路感染以其严重的后遗症(包括肾盂肾炎脓毒症、婴幼儿肾损害和早产等)成为威胁新生儿、老年人和妇女等人群健康的主要疾病之一。本研究结果发现，产ESBLs大肠埃希菌致尿路感染首位发生于泌尿外科，其次为内分泌科和神经外科。分析可能原因，大部分病例有长期留置导尿管、中心静脉置管、体外碎石术、肾移植术、脑室-腹腔分流术等有创操作，部分病例存在糖尿病、自身免疫病、高龄患者等的基础疾病，其机制为临床侵入性操作损伤了机体的黏膜屏障作用，使肠道菌群发生了明显异位，伴随患者组织修复能力减弱及代谢改变，造成机体对病原菌的感染防御功能减低，促使多重耐药菌的感染与传播，这与严海忠等[7]人报道一致。

本研究对天水地区大肠埃希菌尿路感染的耐药性分析，发现产ESBLs大肠埃希菌对19种临床抗生素的耐药率都高于非产酶组，对亚胺培南、美罗培南、磷霉素和呋喃妥因耐药率分别为1.1%，0.9%，4.4%和2.6%，2018年CNINET上半年数据显示，大肠埃希菌对碳青霉烯类的耐药率为1.5%，对磷霉素和呋喃妥因的耐药率分别为5.2%和3.6%，与本研究结果相符。这提示临床，对于急性单纯性下尿路感染的轻症患者，建议应用口服磷霉素氨丁三醇或呋喃妥因治疗，并适用于尿路感染的维持治疗或降阶序贯治疗[8]。但对于有急危重症及放化疗尿路感染患者，建议首选碳青霉烯类治疗[9]。因此，对于产ESBLs 大肠埃希菌引起的尿路感染患者的管理，除根据药物敏感试验结果选择有效抗生素种类外，还需加强床旁的隔离防护措施，避免耐药菌的水平传播。

由质粒介导的ESBLs酶是大肠埃希菌重要耐药机制，目前全世界共发现了200多种ESBLs，根据编码基因的同源性分为blaCTX-M，blaTEM，blaSHV，blaOXA和其他共5大类型[10]。近年来，大肠埃希菌致尿路感染临床治疗现状为，对复杂性尿路感染患者在获得药敏试验结果之前经常采用经验性治疗或不规范的抗生素治疗，导致耐药菌株的出现。CHINET耐药监测网和全国细菌耐药监测网(CRASS)的数据显示，近8年来我国大肠埃希菌产ESBLs发生率在50%～60%，基因型90% 以上为CTX-M型，由于我国人群地域分布特点不同及抗生素的个体化差异，产ESBLs大肠埃希菌菌株的耐药基因表型流行特征也不尽相同[2]。本研究显示，天水地区产ESBLS大肠埃希菌耐药基因型以 blaCTX-M-14表型为主，其次为blaTEM表型，blaSHV和blaOXA表型小于10%，这与徐学静等[11]报道一致，而与周杰等[12-13]报道的blaCTX-M亚型有差别，可能与地域差异及临床用药习惯有关[14]。本研究首次分析了产ESBLs 大肠埃希菌不同携带模式菌株对头孢他啶的耐药率，结果显示，携带blaCTX-M-14型及blaCTX-M-14+ bla-TEM型对头孢他啶具有更高的耐药率，差异有统计学意义。

综上所述，天水地区尿路感染患者产ESBLs大肠埃希菌以bla-CTX-M-14和bla-TEM基因型占绝对优势，携带模式以单一模式为主，复合模式较少见，未见其它模式；产ESBLs菌株呈现多重耐性，但对碳青霉烯类、磷霉素和呋喃妥因呈现较低的耐药率，可指导本地区临床合理使用抗生素和防控该菌耐药基因的水平传播提供参考依据。