支原体肺炎儿童与健康儿童血清拉曼光谱检测的差异性研究*

林小平，刘晓良，余 瑶，赵 芳，苏艳丽

(商洛市中心医院检验科，陕西商洛 726000)

近年来，肺炎支原体肺炎(mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)在儿童中的发病率呈现出逐渐上升的趋势，尤其是3～7岁的儿童，发病率约为44%，并且患儿的年龄趋于低龄化[1-2]，而肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，MP)是儿童发生MPP的主要原因[3]。目前对MP的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术和核酸检测技术、血清学诊断技术等方法，但是这些检测方法目前都存在一定的局限性[4]。基于现有的MP诊断状况，发展一种高灵敏度和便捷的检测手段，对于该病的早期诊断具有非常实用的医学价值。

拉曼光谱技术分析速度快、所需样品浓度低、无需预处理样品、不破坏样品、灵敏度较高，现已成为生物医学诸多研究领域中的有力武器[5]。本研究检测MPP患儿和健康儿童的血清拉曼光谱信号，研究其差异性，初步探索将拉曼光谱检测技术应用到儿童MPP诊断的可行性。

1材料与方法

1.1 研究对象 选取商洛市中心医院2017年4～12月收治的MPP患儿血清100例作为实验组，年龄在8个月～14周岁。另选取同期正常儿童血清100例作为对照组，所有样本均在早晨空腹抽血分离血清待测。

1.2 仪器 采用HORIBA公司的XploRA PLUS全自动显微拉曼系统。

1.3 方法 根据本课题组优化好的血清样本测试方法，选取血清2.5 μl，点至载玻片上，静置孵育30 min；使用全自动显微拉曼系统检测。测试条件如下：激光波长532 nm，光栅1 800 g/mm，激光功率100%，采集时间25 s，采集次数1次，光谱范围400 cm-1～1 800 cm-1。为了减少电噪音、宇宙射线以及光功率波动等不利因素的影响，每个样本测量3次，取平均值，所得光谱进行归一化处理后用于分析。

2结果

2.1 两组血清的拉曼图谱 见图1。在位移490.47，1 152.93，1 515.33，1 653.34cm-1处两组血清的拉曼光谱峰强弱存在差异性。

图1 两组血清的拉曼图谱(a：健康；b：MPP；c：差异谱)

2.2 拉曼光谱峰强度比较 见图2。与对照组相比，在位移1 152.93与1 515.33cm-1处实验组血清拉曼光谱峰得到了增强，两组之间的差异有统计学意义(t=2.027，2.028，均P<0.05)，在位移490.47与1 653.34 cm-1处实验组血清拉曼光谱峰发生了减弱，其中在位移490.47 cm-1处两组之间差异无统计学意义(t=1.260，P>0.05)，在位移1 653.34 cm-1处两组之间差异有统计学意义(t=2.137，P<0.05)。

2.3 拉曼谱峰归属 查阅资料，分析后发现血清各拉曼光谱峰大部分归属于酪氨酸、苯丙氨酸、β-胡萝卜素、酰胺Ⅰ、α螺旋、磷脂、N-乙酰基葡萄糖、D-葡萄糖和葡萄糖醛酸等物质。其中在位移1 152.93，1 515.33 cm-1处拉曼峰主要归属于β-胡萝卜素；在位移1 653.34 cm-1处拉曼峰归属于酰胺Ⅰ、α螺旋和磷脂，见表1。

表1 拉曼光谱峰归属(单位：cm-1)[6-8]

*P<0.05

3讨论肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，MP)是一种原核病原微生物，其大小介于病毒和细菌之间。它是儿童呼吸道感染的重要病原体之一，临床表现复杂多样，发病率逐年上升[9-10]。目前对于MP的检测，无论是病原体分离培养技术、核酸检测技术，还是血清学诊断技术，都存在着一些缺陷[4]：如病原体分离培养技术是诊断MP感染的有效方法，能够直接检测到MP，但是此法检出率低、培养条件严苛、耗时较长、操作复杂， 且在MP感染早期不敏感， 因而临床使用上常受到限制；核酸检测技术虽然敏感性高，但是容易受到污染，假阳性率较高，操作方法复杂，使得目前临床使用受限，大多医院并未广泛应用；血清学诊断技术主要是检测患儿血清中的MP抗体，但阳性结果也不能确诊感染了MP，需要与临床症状结合来进行分析，而部分患者感染MP后不产生抗体或者产生的抗体量特别少，不能被检测出来[11-12]。现有的检测方法的不完善使得MPP的诊断时间延后，影响患者的治疗，因此发展一种灵敏度高、检测时间短、操作简便的MP检测方法具有重要意义。

拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气态、液态和固态，而且每一种物质的拉曼光谱都只与其自身的分子结构有关，与入射光频率无关。近年来，拉曼光谱技术在物质结构分析和物质定性、定量分析等方面的应用得到了快速发展。血清拉曼图谱已经可以作为一种指纹图谱，来反映不同机体内蛋白质、核酸、脂质等生物分子的差异性，用来推断机体生理变化，进而进行相关疾病的诊断[5]。本课题对MPP患儿和健康儿童的血清研究表明，小儿感染MP后，血清拉曼光谱峰的强弱发生了改变。查阅资料，分析相关拉曼光谱峰的归属，发现造成这种改变的原因可能是MPP患儿血清中β-胡萝卜素水平的升高和酰胺Ⅰ与磷脂水平的降低。据此，可以说明MPP患儿与健康儿童血清拉曼光谱信号存在差异性，这就为血清拉曼光谱检测技术应用于儿童MP检测奠定了相关理论基础。但本实验检测的标本量有待扩大，条件需要进一步优化，而且需要研究血清中β-胡萝卜素、酰胺Ⅰ和磷脂水平与MP的相关性，从而为儿童MP的快速检测提供便利。