长链非编码RNA TUG1对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

张科科，耿玉东

口腔鳞状细胞癌 （Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部恶性肿瘤的常见类型，易发生局部浸润性和颈部淋巴结转移，且患者预后较差， 术后 5年生存率约为 50%［1，2］。因此寻找OSCC的治疗靶点，并探讨OSCC发生发展及迁移侵袭的分子机制对于提高OSCC患者术后生存率具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200bp且无编码功能的RNA分子，具有复杂多样的生物学功能，与多种疾病的发生发展及预后密切相关。牛磺酸上调基因1（taurine upregulated geue 1，TUG1） 是一种重要的lncRNA，在胃癌［3］、食管癌［4］及骨肉瘤［5］等多种恶性肿瘤中异常表达，并与肿瘤细胞的增殖、转移侵袭等密切相关［6，7］。 目前关于 TUG1 在 OSCC 发生发展中的作用的研究较少，该研究检测TUG1在OSCC细胞中的表达，并沉默TUG1的表达分析其对OSCC细胞增殖、迁移侵袭的影响，初步探讨其在OSCC中的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂人的正常口腔角质细胞株（hOK）和人口腔鳞状细胞癌SCC-25细胞株均购自北京北纳创联生物技术研究院。RPMI-1640培养基、胎牛血清及胰蛋白酶购自美国Gibco公司，脂质体lipofectamine 2000和Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司，CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司，siRNA及相关引物由北京擎科生物科技有限公司合成，MMP-2、MMP-9及VEGF-C一抗均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养将hOK和SCC-25细胞株接种于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的PRMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，选取对数期生长良好的细胞用于实验。

1.3 RT-PCR使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并使用紫外分光光度计进行RNA定量及纯度分析。使用反转录试剂盒将2 μg总RNA逆转录生成 cDNA。采用 qPCR仪 （Applied Biosystems 7600型，ABI，美国）进行检测，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算细胞中TUG1的相对表达量，相关引物设计见表1。

表 1 引物序列表

1.4 细胞转染将生长状态良好的SCC-25细胞，按照1×104/孔的浓度接种到96孔板中，待细胞融合度达到60%左右进行转染。按照liporfectamine2000转染试剂说明书进行转染实验，分别将siRNA阴性对照（si-NC）序列和 TUG1 siRNA（si-TUG1）序列转染至SCC-25细胞中，每组设6个复孔。

1.5 细胞计数转染24 h后，将SCC25细胞接种至96孔板中，每孔加入新鲜培养基100 μl，并设5个复孔， 分别培养 24、48、72、96 h 后， 加入 10 μl CCK-8溶液，并在培养箱中继续培养2 h。使用酶标仪上检测各样品450 nm处的吸光度值（A值）。

1.6 Transwell检测细胞的迁移与侵袭分别用Transwell小室和Transwell预涂覆基质胶小室进行迁移和侵袭实验。将转染24 h后细胞悬浮液100 μl加入小室的上室中，将 600 μl含有 10%FBS的PRMI-1640培养基或 100 μl稀释后的 Matrigel基质胶均匀加到下室中，37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，用棉签擦去上室细胞，4%多聚甲醛固定迁移到下室的细胞，0.1%结晶紫染色，洗净晾干后，倒置于显微镜下随机选取5个视野进行计数。实验重复3次。

1.7 Western blot实验采用细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白。DAB检测浓度后，采用SDSPAGE电泳，转膜后，用含有5%脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭 1 h，加入 VEGF-C、MMP-2、MMP-9 及β-actin 一抗（1∶2000），4 ℃孵育过夜。 洗膜后，加入二抗 IgG（1∶2000），室温孵育 1 h。 采用电化学发光液进行显影，采用软件Image J进行图像分析。以β-actin为内参，根据条带灰度值计算蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0进行分析。符合正态分布的计量资料采用（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TUG1在OSCC细胞中的表达SCC25细胞中 TUG1-1的表达水平（2.43±0.44）明显高于hOK细胞（1.13±0.31），差异具有统计学意义（t=4.167，P=0.014）。

2.2 siRNA干扰SCC25细胞中TUG1-1的表达qRT-PCR检测发现，siRNA干扰后 SCC25细胞中TUG1的表达水平明显低于对照组和si-NC组，差异具有统计学意义（P＜0.05），且 si-TUG1-3的干扰效果最佳，见表2，因此选用si-TUG1-3进行后续实验。

表 2 转染不同siRNA序列对SCC25细胞中TUG1表达的影响

2.3 沉默TUG1对SCC25细胞增殖能力的影响CCK-8实验结果见图1，结果显示：转染48、72及96 h后，si-TUG1组SCC25细胞的吸光度值明显低于对照组和si-NC组，差异具有统计学意义 （P＜0.05），表明沉默TUG1能抑制SCC25细胞的增殖能力。

图 1 转染siRNA后，SCC25细胞的增殖活性

2.4 沉默TUG1对SCC25细胞迁移、侵袭能力的影响Transwell法检测结果见图2（见封三），结果显示，si-TUG1组中细胞的迁移和侵袭数量明显低于对照组和si-NC组，差异具有统计学意义 （P＜0.05），同时Western blot检测迁移和侵袭相关蛋白的表达发现，si-TUG1组中 MMP-2、MMP-9和VEGF-C蛋白的表达水平明显低于对照组和si-NC组（P＜0.05），提示沉默 TUG1能够抑制SCC25细胞的迁移和侵袭能力。

图2见封三。

图 3 Western blot检测相关蛋白表达

3 讨论

目前lncRNA已成为生物医学领域的研究热点。尽管lncRNA不具备蛋白质编码能力，但其能够在表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多个层面调控下游目标基因的表达，在细胞增殖、分化、脂质代谢、疾病的发生及免疫调节等多种生理病理学过程中发挥着重要作用，可作为肿瘤早期诊断、预后评估及靶向治疗的靶点［8-10］。

研究证实，lncRNA TUG1在多种恶性肿瘤中异常高表达，与癌细胞的增殖、迁移和侵袭等行为密切相关［11-14］。 赵筱倩等［15］研究发现 TUG1 在乳腺浸润性导管癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，与肿瘤直径、TNM分期明显相关，沉默TUG1可显著抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡；此外该研究还发现沉默TUG1可上调抑癌基因p27的表达水平，提示TUG1可能是通过下调抑癌基因p27的表达来促进乳腺浸润性导管癌细胞的生长。Hu等［16］研究发现TUG1在宫颈癌组织和4个宫颈癌细胞系中均显著上调，TUG1高表达与肿瘤体积、分期及淋巴结转移相关，且沉默TUG1能激活细胞凋亡、抑制细胞增殖。Gao等［17］研究表明过表达TUG1能促进T24和EJ细胞的增殖、迁移和侵袭，沉默 TUG1则抑制细胞增殖、迁移和侵袭，同时该研究还提示TUG1可能是通过过抑制miR-29c促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Liang等［18］研究发现沉默TUG1的表达可以抑制Tca8113和TSCCA口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭。该研究同样发现TUG1在SCC25细胞株中表达上调，采用siRNA干扰TUG1的表达能够抑制SCC25细胞的增殖、迁移和侵袭能力，即TUG1促进了口腔鳞癌细胞SCC25的增殖、迁移和侵袭，在口腔鳞癌中具有癌基因的活性。该结果提示不同OSCC细胞系中TUG1均能促进癌细胞的增殖、侵袭。但TUG是如何调控口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移及其相关蛋白的表达及TUG1的作用是否受其他非编码RNA的影响等还有待后续研究深入探讨。

综上所述，TUG1在OSCC细胞中高表达，沉默TUG1能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示TUG1可能是口腔鳞癌潜在的治疗靶点。