转录因子ZBTB18对结直肠癌细胞转移的影响

田 力，刘 波，彭朝胜，夏 菁，吕贯廷

结直肠癌是目前世界上常见的恶性消化道肿瘤之一，每年大约有50万患者死于结直肠癌[1-2]。在我国常见恶性肿瘤中，结直肠癌死亡率在男性中居第五位，女性中居第六位[3]。随着我国居民饮食和生活习惯的改变，近二十年来结直肠癌的发病率在逐渐升高[4]。肝转移是结直肠癌主要的死亡原因之一[2]，约20%的结直肠癌患者在确诊的同时发现有肝转移，40%的结直肠癌患者在确诊后一段时间后出现肝转移，如不及时治疗，结直肠癌肝转移患者生存5～10个月的比例为50%，2年生存率仅为3%[5]，由此可见肿瘤转移是控制结直肠癌的关键。

ZBTB18(又被称为ZNF238、RP58、TAZ-1和C2H2-171)是一种含有C2H2型锌指结构的蛋白，可抑制脑细胞内相关的基因表达，参与神经系统的发育，该基因的突变会导致神经系统发育异常[6-8]。有研究发现，ZBTB18在脑瘤中的高表达可显著抑制肿瘤的生长，具有肿瘤抑制因子的作用[9-10]。

然而ZBTB18在结肠癌中的作用尚不明确。为了研究ZBTB18是否在结直肠癌中发挥肿瘤抑制的功能，我们从NCBI GEO数据库中下载肿瘤基因表达谱数据，对ZBTB18在结直肠癌中的表达水平进行分析，并在具有不同转移水平的结直肠癌细胞系中的表达进行检测，同时结合Transwell实验来分析ZBTB18在结直肠癌中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料 从NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)公共数据库中下载人基因表达谱数据GSE1035129[11]。该数据集包括了65个乳腺癌组织及10个对照组织、57个结直肠癌组织及12个对照组织、60个非小细胞肺癌组织及9个对照组织和60个前列腺癌组织及7个对照组织，以上样本使用Affymetrix HT-U133plus-2-PM芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)进行检测。我们从GSE1035129数据中，收集结直肠癌样本中ZBTB18的数据进行后续分析。

1.2 细胞系 结直肠癌细胞系DLD1、HCT116、HCC2998、SW480、HCT115、KM12、HT29、COLO205和SW620购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心或美国全球生物资源中心。采用含有5%胎牛血清的DMEM培养基进行细胞培养。

1.3 ZBTB18短发夹RNA慢病毒表达载体的构建 通过Ambion网站，针对ZBTB18 mRNA序列(NM_205768)设计了3组短发夹RNA(short-hairpin RNA，shRNA)，以便从中筛选得到最优的序列(表1)。把shRNA-F(Foward)和shRNA-R(Reverse)等量混合后，置于沸水中，让其缓慢降至室温进行复性，短暂离心后置于4 ℃保存；将pLKO.1-puro慢病毒载体用限制性内切酶AgeI和EcoRI进行酶切及胶回收；把复性的shRNA双链与酶切处理的pKLO.1-puro质粒进行连接，连接反应用DNA ligation kit(6022Q，Takara)进行，具体操作参考试剂盒说明书。连接成功的质粒进行Sanger测序鉴定并制备慢病毒。

表1 ZBTB18 shRNA核酸序列

1.4 荧光定量PCR检测 利用SYBR Green PCR Master Mix(4309155，Applied Biosystems)通过ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Waltham,MA,USA)来进行定量PCR检测，检测引物见表2。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参，每个样品做3个平行，阴性对照中cDNA模板以三蒸水代替。采用ΔΔCt法作相对定量，计算出目的基因在不同细胞中表达量的相对比率。其中Ct值指的是目的基因的量达到域值时所经历的扩增循环数，因此Ct值越大则模板量越小。相对表达量的计算根据下列公式：Ratio=2-ΔΔCt=2-[ΔCt(sample)-ΔCt(control)]。其中ΔCt=Ct(ZBTB18)-Ct(GAPDH)，以此除去起始模板量所引起的差异。

表2 荧光定量PCR检测引物

1.5 Transwell细胞侵袭及迁移实验 用4 ℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1 mg/mL，在Transwell细胞培养板的chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀释后的Matrigel，37 ℃温育30 min使其成胶状；把细胞用无血清培养基悬浮，调整浓度为2×105/mL；在下室加入600～800 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，上室加入200 μL细胞悬液，继续在37 ℃ 5% CO2孵箱中培养12 h；取出chamber，吸干上室液体，用甲醇室温固定30 min；加入约800 μL苏木精染液,室温染色30 min；取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。细胞迁移实验不需铺Matrigel，其他步骤相同。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13和GraphPad Prism 5软件进行处理，基因在结直肠癌组织和正常对照组织中的差异表达使用两独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中ZBTB18表达数据分析 通过对NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)公共数据库中结直肠癌样本表达芯片数据的分析发现ZBTB18在结直肠癌组织样本中的表达水平显著高于正常组织(P=0.000 99,图1A)。进一步分析ZBTB18在结直肠癌中的表达量，挑选了9种不同的结直肠癌细胞系(表3)，其中7种为原发性结直肠癌细胞系，2种为转移性结直肠癌细胞系。用定量PCR检测不同结直肠癌细胞系中ZBTB18的表达量。结果发现，在转移性结直肠癌细胞系中，ZBTB18的表达水平高于原发性结直肠癌细胞，差异比较具有统计学意义(P=0.021 5，图1B)，提示ZBTB18与结直肠细胞转移能力正相关。

图1 ZBTB18结直肠癌组织及不同的肠癌细胞系中的表达水平

细胞系分化情况DLD1原发性肠癌HCT116分化差的原发性肠癌HCC2998分化较好的原发性肠癌SW480原发性腺癌HCT15初中度分化的肠癌KM12中度分化的肠癌HT29分化差的原发性肠癌COLO205转移的肠腺癌SW620淋巴结转移的肠腺癌

2.2 shRNA对ZBTB18的沉默 成功构建了3组针对ZBTB18的shRNA质粒，利用慢病毒包转质粒感染HT29细胞，嘌呤霉素筛选得到稳定干扰ZBTB18表达的细胞系，利用定量PCR及半定量PCR检测设计的3组shRNA对ZBTB18表达的影响。结果表明，3组shRNA都显著降低了ZBTB18的表达，尤其shRNA1与shRNA3的影响更加明显(图2)。

A:定量PCR检测shRNA对ZBTB18的沉默效果；B:半定量PCR检测shRNA对ZBTB18的沉默效果图2 shRNA对ZBTB18表达的沉默效果

2.3 ZBTB18沉默后对结直肠癌细胞侵袭和迁移的影响 利用Transwell实验对pLKO.1-ZBTB18-shRNA3稳转的HT29细胞的迁移和侵袭能力进行分析。结果显示，当ZBTB18沉默后，HT29细胞的迁移和侵袭有显著的降低(P<0.05，图3)。

图3 Transwell实验结果

3 讨论

肿瘤转移是涉及多基因变化的一系列复杂过程，包括肿瘤从原发部位脱落，进入血管淋巴，粘附于内皮细胞，诱导血管生成对抗宿主，在远端部位增殖形成转移灶，整个过程受到许多基因的调控。与肿瘤转移相关的基因可以分为肿瘤转移促进基因及肿瘤转移抑制基因，目前认为，肿瘤转移相关基因的激活或肿瘤转移抑制相关基因的失活均可导致肿瘤细胞性状发生转变而发生转移[12-13]。研究表明，至少有10余种癌基因可诱发或促进肿瘤细胞的转移能力，如MYC[14]、KRAS[15]、BRAF[16]、FES[17]、FMS[18]、WWOX[19]等，相对的转移抑制基因主要包括参与细胞生理活动调节的NM23[20]、PTEN[21]、TIMP1[22]等。

ZBTB18蛋白在正常脑组织中高表达，但在脑瘤呈低表达，增加ZBTB18的表达水平则可抑制肿瘤的生长[10]。在脑胶质瘤中，ZBTB18基因的启动子被异常甲基化，导致其表达沉默；ZBTB18的缺失可调控预后不良相关基因的表达，促进胶质母细胞瘤出现侵袭表型[9]。目前有关ZBTB18的研究主要集中于脑发育方面。ZBTB18基因的功能缺失性突变(错义突变和拷贝数缺失)可导致脑新皮层和海马发育不良、皮层成熟神经元数量减少以及由于皮质板内神经元的异常迁移而导致的层状组织缺陷为主要特征的1q43q44微缺失综合征[7-8,23]。

然而ZBTB18基因在其他组织和肿瘤中的功能研究尚未明确。我们通过对NCBI GEO公共数据库中结直肠癌样本表达芯片数据分析发现，ZBTB18在结直肠癌样本中高表达，与正常对照样本相比具有显著差异，这一发现提示，ZBTB18可能在不同的癌症中发挥着不同的作用。随后在不同的结直肠癌细胞系中发现，高转移性肠癌细胞中ZBTB18的表达水平要显著高于原发性肠癌(P=0.021 5)。当把ZBTB18表达水平敲低后，HT29细胞的侵袭和转移能力均显著降低。这表明，在肠癌细胞系中，ZBTB18的功能与脑胶质瘤相反，具有促进肿瘤的功能，为癌基因。而该基因在结直肠癌中的作用机理还需进一步详细研究，为结直肠癌及其他癌症提供重要线索和依据。