斑马鱼作为肺癌模型的应用进展

俞华林 李鹏飞 汪丽

[摘要]肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居全球首位。因此，进一步了解肺癌发生发展的相关分子机制及致病机制，评价抗肺癌药物的疗效和安全性，对肺癌的诊断及治疗都有重要意义，也为早日实现保障民生健康的改革发展理念添砖加瓦。斑马鱼是一种重要的模式生物，其基因与人类基因高度保守，生长速度快，最重要的是斑马鱼早期胚胎透明，有助于对发育过程进行实时观测。在现代生物研究中，斑马鱼作为人类疾病模型得到充分的应用。本文主要阐述了斑马鱼在肺癌研究领域中的应用及研究进展，认为用斑马鱼构建肺癌模型技术已相当成熟。随着实验技术的不断发展，其在肺癌相关研究领域的应用和发展将取得更大的进步。

[关键词]综述；肺癌；斑马鱼；模式生物；分子机制；抗癌药物；进展

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0025-04

[Abstract] Lung cancer is one of the most common human malignancy. Its morbidity and mortality are the highest in the world. Therefore， it is of great significance for the diagnosis and treatment of lung cancer to further understand the related molecular mechanisms and pathogenesis of lung cancer and evaluate the efficacy and safety of anti-lung cancer drugs. And also for the early realization of the countrys security health reform and development of the concept of the people′s livelihood. Zebrafish is a kind of important model organisms. Their genes with human genes are highly conserved， growth speed quick. The most important thing is that early embryonic Zebrafish transparent， which will help the development process for real-time observation. In modern biological research， Zebrafish as a model of human disease are fully applied. This article mainly elaborated the zebrafish in lung cancer research in the field of application and research progress. It′s thought that use Zebrafish lung cancer model construction technology already quite mature. With the continuous development of experimental technology， its application and development in the field of lung cancer related research will make greater progress.

[Key words] Review； Lung cancer； Zebrafish； Model organisms； Molecular mechanisms； Anticancer drugs； Progress

肺癌是目前全世界最常見的致死性肿瘤之一，死亡数约占所有癌症死亡数的30%，中国每年有140万人死于肺癌，每年新发肺癌患者大约有160万人次[1]。根据组织病理分类，肺癌又可以分为小细胞肺癌（NSCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中SCLC约占20%，NSCLC约占80%[2]。故加强对肺癌的研究仍然是当前保障民生的重要任务。目前对肺癌的治疗，一般包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、免疫治疗、以及分子靶向治疗等，其中肺癌的个体化治疗是当下的一个热门话题[3]，然而利用斑马鱼肿瘤模型可用于发现新的免疫检查点，开发肿瘤新靶点、多靶点抗肿瘤药，以达到对肿瘤患者个体化给药；利用斑马鱼模型进一步研究肿瘤耐药分子机制，为临床合理调整肿瘤患者用药提供理论依据。

1肺癌的分子机制

随着科学技术的发展，研究者们已经开展了关于肺癌分子机制的各项研究，进一步揭开了肺癌发生发展的病理机制，从而为其治疗水平提上了一个新台阶。

免疫治疗成为当下肺癌治疗的一个热门话题，Mu等[4]研究发现，PD1及其配体PD-L1在NSCLC中极其普遍，PD1在NSCLC的肿瘤浸润性T细胞中高表达，与肿瘤细胞高表达的PD-L1结合，传递负性调控信号，从而导致肿瘤抗原特异性T细胞的诱导凋亡和免疫无应答，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤，PD1、PD-L1抑制剂的研究及应用为肺癌患者带来福音。

PAQR又被称为黄体酮和脂联素（adipoq）受体家族，是一个高度保守的蛋白质家族，共有11个成员，即从PAQR1到PAQR11，其已被证实在多种肿瘤中作为肿瘤抑制因子，近来 Li等[5]研究发现，在NSCLC中，PAQR3在mRNA和蛋白水平均表达下调，其低表达在肺癌的发生发展中发挥重要作用。PAQR3过表达可显著抑制NSCLC细胞G0/G1期增殖，并诱导细胞凋亡，促进细胞周期阻滞（P<0.05），研究还发现PAQR主要是通过PI3K/AKT通路抑制肺癌的发生。p53丢失以及Bcl/BclxL的过表达是肿瘤抗凋亡的主要分子机制，有研究指出，整合素a3和Bcl-2蛋白参与肺癌患者的预后。

Phiboonchaiyanan等[6]研究发现Phoyunnanin E通过活化caspase-3、-9和poly（adp-核糖）聚合酶切割，对H469肺癌细胞系有明显的诱导凋亡作用，其主要是通过p53依赖性途径来增加细胞p53蛋白的积累从而介导凋亡。并发现抗凋亡蛋白，如诱导的骨髓白血病细胞分化蛋白（MCL1）和B细胞淋巴瘤2（BCL2）显著减少，而促凋亡的Bcl-2相关的X蛋白（BAX）被上调。

Yan等[7]研究发现高良姜素通过诱导Topoi构象重新的折叠，使α螺旋含量增加，而不利于其形成活性中心，进而导致Topoi活性的降低，从而对其有较好的抑制作用；研究发现高良姜素能够优先结合到Topoi的活性中心附近，并与催化基MAr9364和lAsn352形成氢键，而使肿瘤细胞DNA单链解旋的速率降低，最终诱导肺癌肿瘤细胞株A549和H46的凋亡，进而达到抑癌作用。Yang等[8]的最近一项Meta分析的结果显示，E-钙粘素的表达下调和NSCLC发生发展有关，其可作为NSCLC患者的预后因子[8]。研究还发现E-钙粘素不仅能直接调节细胞间的黏附作用，还能通过受体酪氨酸激酶产生调节表皮生长因子受体活性和影响GTP酶活性的8-连环蛋白在细胞内信号间接发挥功能。

2斑马鱼成为生物模型的优势

利用斑马鱼做科学研究已有80多年的历史。早在19世纪，斑马鱼发现于印度恒河流域，为淡水鱼，属脊椎动物亚门辐鳍鱼纲鲤科[9]。早期，斑马鱼主要被用于胚胎发育和药物处理研究。19世纪80年代，斑马鱼开始被应用于分子遗传学研究，至此，斑马鱼作为生物模型的黄金时代拉开帷幕。

斑马鱼（Zebrafish）是近年来新兴发展起来的用于研究脊椎动物肿瘤发病学和发育遗传学的一种模式生物[10-11]。其作为一种新型的模式动物，以其独特的优势，已成为现代遗传学、发育生物学等研究领域的重要模式生物[12]。斑马鱼作为生物模型具有如下优势：①斑马鱼体型小，且为体外受精，受精卵发育迅速，受精后24 h即开始了器官发生，受精后5 d左右，其主要器官已发育完全，并执行相应功能；成年后，繁殖力强，产胚量多，且适合于实验室饲养，这些都为斑马鱼成功加入到科学研究队伍里提供了条件。②斑马鱼在幼鱼阶段适应性免疫功能不全，易于肿瘤异种移植[13]；斑马鱼肿瘤异种移植模型本身有极大的优势，并且克服了小鼠的许多不足之处[14-15]。最重要的是其与人类的基因序列保持高度的相似性，约达87%，这些均为斑马鱼作为人类疾病模型奠定了重要的理论基础。

作为研究肿瘤模型工具，斑马鱼被称作是一种理想的脊椎动物模型。归结原因如下：①从肿瘤的生物学角度来说，鱼和人的肿瘤在组织学上是非常相似的。②鱼的肿瘤竟然与人类一样，也具有遗传性。研究比较人和鱼的基因序列，发现在细胞周期基因、肿瘤抑制因子、以及致癌基因等方面都具有保守性。③在药物作用方面，发现虽然斑马鱼与人的蛋白同源性<70%，但蛋白功能域（如药物作用的靶点）的同源性接近100%。④斑马鱼的胚胎和肿瘤具有相似的特征：比如细胞分裂快、细胞凋亡速度延缓和血管生成旺盛等。

综上所述，斑马鱼作为肿瘤模式生物日益受到关注，目前其研究主要集中在肿瘤血管生成和细胞凋亡两方面。

3斑马鱼所患的肺癌

尽管斑马鱼没有肺器官，依靠鱼鳃辅助呼吸。但先前有研究成功构建出斑马鱼胚胎移植乳腺癌，其也无乳腺组织，未做到组织器官发病，不过癌细胞在斑马鱼胚胎中的存活、促血管生成、迁移特征、及相关分子的表达都具有极高相似度；同时肿瘤标志物的相关因子如VEGF、HER2等重要靶点与人类有较高的保守性[16]，对于靶点药物的评价也展示出了良好的适用性，在抗肿瘤的应用研究中得到很大认可。故研究者们开始大胆设想并进行研究，目前已经有关以斑马鱼为模型来研究抗肺癌药物疗效，如Vinothkumar等[17]的研究，说明以斑马鱼模型替代小鼠模型进一步验证石墨烯对NSCLC有一定的抑癌作用，所以至此一大批以斑马鱼模型研究探究肺癌药物的有效性和安全性的试验将如雨后春笋般涌现，这也将进一步推动肺癌研究领域的快速发展。

4斑马鱼肿瘤模型建立技术

目前构建各种良、恶性肿瘤模型的方法包括基因突变、人类肿瘤细胞移植、直接致癌药物干预等。总结其肿瘤模型可分为以下3类：基因突变模型，化学诱导致癌模型，基因组改造模型[18]。由于斑马鱼与人类基因具有高度的同源性，各类肿瘤模型在组织学上与人类肿瘤是有高度一致性的。结合小分子筛选技术、遗传分析和癌变检测技术，斑马鱼正被广泛用于新的肿瘤相关基因的发现及抗肿瘤药物的筛选中[19-20]。斑马鱼的操作技术包括最常用的注射，其是在胚胎发育早期阶段进行的；原位杂交技术是斑马鱼研究中最古老的方法之一；原位标记是斑马鱼研究中最经典的方式，是通过着色标记探针，用光学显微镜检测信号；移植是发育生物学中应用得最古老的方法之一。在移植过程中，一团细胞从供体胚胎中移出，植入受体胚胎中；以及对基因表达下调、定向突变、转基因工具和嵌合实验。斑马鱼已经成为生物医学研究中重要的体内模型，且已经开发和利用有效的方法来提供解决方案中的化合物或药剂。最新研究表示，除了传统的口服用药和静脉给药，更推荐强饲，即一种灌胃程序，能更好的利于斑马鱼吸收，从而得出更精确的试验数据[21]。这些技术的开发和应用都为斑马鱼在肿瘤模型及抗肿瘤新药研究的发展打下坚实的基础。

5斑马鱼肺癌模型的建立

许多研究者坚信斑马鱼能在科研道路上开辟出来一片新天地，一直倡导并致力借此研究肿瘤，现已卓有建树。已有研究发现以成年斑马鱼为模式生物，对其进行肌肉注射5 μl的A549细胞，然后间隔14 d后，继续注射。

5 μl的A549细胞。将鱼置于21.l℃的水箱中，14/10 h的光周期和暗周期，如常喂養60 d，最后发展成肿瘤，但目前还没有关于可用H60细胞系成功构建斑马鱼肺癌模型的研究[22]。

通过研究斑马鱼黑色素瘤模型，研究者们已经获得多种治疗人类相应癌症的先导化合物[23]。有研究者以斑马鱼模型进一步探索肺癌细胞的侵袭和转移能力及其发生发展的分子机制，如Eramo等[24]在NSCLC和SCLC中均发现了CD133肿瘤细胞，CD133是一种拥有极强的侵袭和转移能力的肺癌肿瘤干细胞，其通过Notch及Wnt两条通路来维持自我更新和无限增殖分化。相对来说，斑马鱼肺癌模型研究尚只应用于肺癌抗肿瘤药物疗效评价。劳乔聪等[25]借鉴斑马鱼肿瘤异种移植模型设计出斑马鱼肺癌异种移植模型，研究抗肺癌A549药敏试验中，药效从高到低分别为贝伐单抗（65%）>顺铂（55%）>长春瑞滨（40%）>恩度（39%）>紫杉醇（27%）[26]。亦有研究者利用斑马鱼移植肺癌模型研究鱼藤素的抑癌效果。

6小结

斑马鱼自身的众多特点使其在生物模型中备受研究者们青睐，其移植瘤模型的制作方法简便、重复性佳、周期且短，加之斑马鱼基因测序工程的完成，揭示其基因组与人类基因组的相似性高达87%[27]，在多种癌细胞的迁移研究和药物活性评价方面具有独特优势。从目前的研究来看，随着斑马鱼肿瘤模型的不断深入研究，尤其是斑马鱼肺癌模型构建技术的不断成熟，这将为肺癌的相关分子研究机制拉开新的研究途径，同时也为接下来一大批肺癌耐药机制的研究及新药的研制提供更具优势的生物工具，且斑马鱼在抗癌药体内药敏试验方面具有独特的优势，可供研究者继续挖掘。

[参考文献]

[1]Lee SH，Jaganath IB，Manikam R，et al.Inhibition of Raf MEK-ERK and hypoxia pathways by phyllanthus prevents me-tastasis in human lung（A549）cancer cell line[J].BMC Complement Alterm Med，2013，13（1）：271-291.

[2]李昊，钟理，丁浩，等.肺癌的个体化治疗进展与展望[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（2）：196-199.

[3]姜北，李晶，万鹏，等.EGFR-TKIs在晚期非小细胞肺癌靶向治疗中的临床研究[J].现代生物医学进展，2013，11（8）：1489-1492.

[4]Mu CY，Huang JA，Chen Y，et al.High expression of PD-L1 in lung cancer May contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation[J].Med Oncol，2011，28（3）：682-688.

[5]Li XH，Li MF，Chen D，et al.PAQR3 inhibits proliferation via suppressing PI3K/AKT signaling pathway in non-small cell lung cancer[J].Arch Med Sci，2018，14（6）：1289-1297.

[6]Phiboonchaiyanan PP，Petpiroon N，Sritularak B，et al.Phoyunnanin E induces apoptosis of Non-small cell lung cancer cells via p53 activation and down-regulation of survivin[J].Anticancer Res，2018，38（11）：6281-6290.

[7]Yan J，Zhang G，Hu Y，et al.Effect of luteolin on xanthine oxidase：inhibition kinetics and interaction mechanism merging with docking simulation[J].Food Chem，2013，141（4）：3766-3773.

[8]Yang YL，Chen MW，Xian L.Prognostic and clinicopatho-logical significance of downregulated E-cadherin expression in patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）：a metaanalysis[J].PLoS One，2014，9（6）：e99763.

[9]Williams GH，Stoeber K.The cell cycle and cancer[J].J Pathol，2012，226（2）：352-364.

[10]Teittinen KJ，Gronroos T，Parikka M，et al.The zebrafish as a tool in leukemia research[J].Leuk Res，2012，36（9）：1082-1088.

[11]Konantz M，Balci TB，Hartwig UF，et al.Zebrafish xenografls as a tool for in vivo studies on human cancer[J].Ann N Y Acad Sci，2012，1266：124-137.

[12]李強，张晶晶.模式动物斑马鱼在组织屏障发育及功能研究中的进展[J].中国实验动物学报，2015，10（5）：523-528.

[13]Veinotte CJ，Dellaire G，Berman JN.Hooking the big one：the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomicera[J].Dis Model Mech，2014，7（7）：745-754.

[14]Zhang B，Xuan C，Ji Y，et al.Zebrafish xenotransplantation as a tool for invivo cancer study[J].Fam Cancer，2015，14（3）：487-493.

[15]SchartlM.Beyond the zebrafish：diverse fish species for modeling human disease[J].Dis Model Mech，2014，7（2）：181-192.

[16]陈锡强，韩利文，王希敏，等.人乳腺癌斑马鱼移植瘤模型建立[J].中国药理学通报，2016，32（1）：128-132.

[17]Vinothkumar R，Ceasar SA，Divyarupa A.Chemosuppressive effect of plumbagin on human non small lung cancer cell xenotransplanted zebrafish[J].Indian J Cancer，2017，54（1）：253-256.

[18]辛胜昌，赵艳秋，李松，等.斑马鱼模型在药物筛选中的作用[J].遗传，2012，34（9）：1144-1152.

[19]Amatruda JF，Shepard JL，Stern HM，et al.Zebrafish as a cancer model system[J].Cancer Cell，2002，1（3）：229-231.

[20]Stern HM，Zon LI.Cancer genetics and drug discovery in the zebrafish[J].Nat Rev Cancer，2003，3（7）：533-539.

[21]Collymore C，Rasmussen S，Tolwani RJ.Gavaging adult zebrafish[J].J Vis Exp，2013，（78）：e50691.

[22]Stoletov K，Klemke R.Catch of the day：Zebrafish as a human cancer model[J].Oncogene，2008，27（33）：4509-4520.

[23]Cusick MF，Libbey JE，Trede NS，et al.Human T cell expansion and experimental autoimmune encephalomyelitis inhibited by Lenaldekar，a small molecule discovered in a Zebrafish screen[J].J Neuroimmunol，2012，244（1-2）：35-44.

[24]Eramo A，Lotti F，Sette G，et al.Identification and expan-sion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J].Cell Death Differ，2008，15（3）：504-514.

[25]Lee LM，Seftor EA，Bonde G，et al.The fate of human malignant melanoma cells transplanted in tozebrafish embryos：as sessment of migration and cell division in the absence of tumor formation[J].Dev Dyn，2005，233（4）：1560-1570.

[26]勞乔聪，徐懿乔，金凡茂，等.斑马鱼肿瘤异种移植模型在抗癌药敏感性评价中的应用[J].中国比较医学杂志，2017，27（11）：25-31.

[27]Howe K，Clark MD，Torroja CF，et al.The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome[J].Nature，2013，496（7446）：498-503.

（收稿日期：2018-10-30 本文编辑：崔建中）