ANO1蛋白在胃腺癌组织中表达及临床意义

白璐 王涛 张喆

[摘要]目的 分析胃腺癌及正常胃黏膜组织切片中Anoamin1（ANO1）蛋白的表达情况，探讨ANO1蛋白在胃腺癌发生发展中的作用。方法 应用免疫组织化学方法检测2016年1月～2018年6月中国医科大学附属盛京医院78例胃腺癌、沈阳金域医学检验所21例正常胃黏膜组织中ANO1蛋白的表达情况。分析对比ANO1蛋白在胃腺癌及正常胃黏膜组织中的表达差异，研究ANO1蛋白与胃腺癌患者临床病理指标之间的相关性。结果 胃腺癌组织中ANO1蛋白表达阳性率为43.59%（34/78），高于正常胃黏膜组织的14.29%（3/21），差异有统计学意义（χ2=6.070，P=0.014）。不同年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移及长期饮酒情况下的ANO1蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不同分化程度及HER2情況下的ANO1蛋白表达阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。患者胃腺癌ANO1蛋白表达与年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移情况及长期饮酒情况无关（P>0.05），与肿瘤分化程度、HER2均成负相关（r=-0.276、-0.315，P=0.015、0.005）。结论 ANO1蛋白在胃腺癌中的表达升高，ANO1蛋白阳性更多出现在肿瘤分化程度低、HER2蛋白阴性的患者中，ANO1蛋白在胃腺癌发生发展中发挥重要作用。

[关键词]ANO1；胃腺癌；HER2

[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of Anoamin1 （ANO1） protein in gastric adenocarcinoma and normal gastric mucosal tissue sections and to explore the role of ANO1 protein in the development of gastric adenocarcinoma. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of ANO1 protein in 78 cases of gastric adenocarcinoma from Shengjing Hospital of China Medical University and the expression of ANO1 protein in 21 cases of normal gastric mucosa tissues from Shenyang Jinyu Medical Laboratory from January 2016 to February 2018. The difference in the expression of ANO1 protein in gastric adenocarcinoma and normal gastric mucosa was analyzed and compared， and the correlation between ANO1 protein and clinicopathological parameters of gastric adenocarcinoma patients was studied. Results The positive rate of ANO1 protein expression in gastric adenocarcinoma tissues was 43.59% （34/78）， which was higher than that in normal gastric mucosa tissues accounting for 14.29% （3/21）， and the difference was statistically significant （χ2=6.070， P=0.014）. There was no significant difference in the positive rate of ANO1 protein expression in different ages， genders， tumor diameters， depth of invasion， lymph node metastasis and long-term drinking （P>0.05）. The positive rate of ANO1 protein expression in different degrees of differentiation and HER2 was statistically significant （P<0.05）. The expression of ANO1 protein in gastric adenocarcinoma was not associated with age， gender， tumor diameter， depth of invasion， lymph node metastasis and long-term drinking status （P>0.05）. ANO1 protein expression was negatively correlated with tumor differentiation and HER2 （r=-0.276， -0.315； P=0.015， 0.005）. Conclusion The expression of ANO1 protein in gastric adenocarcinoma increases， and ANO1 protein positivity is more common in patients with low tumor differentiation and HER2 protein negative. ANO1 protein plays an important role in the development of gastric adenocarcinoma.

[Key words] ANO1； Gastric adenocarcinoma； HER2

胃癌是一种具有高侵袭性和致命性的恶性肿瘤，占全球新发癌症病例的8.6%，是癌症相关死亡的第二大原因[1]，其恶性程度高，多数患者死于肿瘤的复发和远处转移。因此明确与胃腺癌发生及转移的分子机制有重要临床指导意义。Anoamin1（ANO1）蛋白又称为跨膜蛋白16A，是钙离子激活氯离子通道蛋白家族成员之一[2]。研究表明ANO1多种恶性肿瘤中过表达且与患者的不良预后相关[3]。但ANO1蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义的报道少见。本研究拟采用免疫组织化学染色方法，检测胃腺癌及正常黏膜组织中ANO1的表达，初步探索ANO1蛋白在胃腺癌发生发展中的潜在机制及临床意义，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月～2018年6月中国医科大学附属盛京医院胃癌手术患者78例，以沈阳金域医学检验所电子内窥镜活检慢性胃炎样本21例正常胃黏膜进行对照。患者年龄32～82岁，中位年龄64岁。78例胃癌患者均经病理组织学证实诊断为胃腺癌，其中高分化胃腺癌16例，中分化胃腺癌34例，低分化胃腺癌28例。患者饮酒情况以患者住院病历为准。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2免疫组织化学染色

胃腺癌组织及正常胃黏膜蜡块3 μm切片，采用二甲苯脱蜡，pH=6柠檬酸的柠檬酸修复抗原，3%去离子水封闭内源性过氧化氢酶，ANO1一抗（美国Santa Cruz公司，产品序列sc-377115）1∶200倍稀释在恒温冰箱孵育过夜，二抗为山羊抗兔/鼠聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司，产品序号PV-6000），DAB显色剂及苏木素染色均按照说明书进行。

1.3观察指标及评价标准

比较胃腺癌及正常胃黏膜组织中ANO1蛋白的表达情况，分析胃腺癌患者不同年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移、分化程度低、HER2及长期饮酒情况下的ANO1蛋白表达阳性率。

ANO1蛋白阳性表达信号主要位于细胞膜/质，参照文献[4]判定标准，蛋白表达水平采用染色细胞面积及染色强度评分综合判断，染色面积与染色强度评分乘积≥4分计为阳性，其中按照染色面积分<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%分别为1、2、3、4分；按照染色强度分无阳性、浅黄色、深黄色、褐黄色分别为0、1、2、3分。

1.4统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性研究采用Spearman分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胃腺癌及正常胃黏膜组织中ANO1蛋白的表达情况

ANO1蛋白免疫组织化学染色定位于细胞膜，阳性细胞膜染色呈黄褐色（图1，见封四）。78例胃腺癌患者组织中，34例ANO1蛋白阳性，阳性率为43.59%（34/78），高于正常胃黏膜组织的14.29%（3/21），差异有统计学意义（χ2=6.070，P=0.014）。

2.2 ANO1蛋白在胃腺癌组织中的表达情况

不同年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移及长期饮酒情况下的ANO1蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不同分化程度及HER2情况下的ANO1蛋白表达阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3胃腺癌ANO1蛋白表达与临床病理指标的相关性分析

患者胃腺癌ANO1蛋白表达与年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移情况及长期饮酒情况无关（P>0.05），与肿瘤分化程度、HER2均成负相关（r=-0.276、-0.315，P=0.015、0.005）（表2）。

3讨论

胃腺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤中之一，在我国消化道的恶性肿瘤中居第2位[1]。目前对于胃癌治疗首选手术治疗，术后辅助放疗、化疗等恶性肿瘤综合治疗，但由于肿瘤被发现时经常已经出现了肿瘤的转移，疗效并不满意，因此探索肿瘤的发病机制，早期发现早期治疗格外重要[5]。钙激活的氯离子通道（CaCCss）分布在平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞等兴奋细胞及上皮细胞等非兴奋细胞，具有广泛的生理作用。钙激活的氯离子通道蛋白A（TMEM16A）家族是CaCCss的分子基础，TMEM16A也因为含有阴离子通道（Anion）又称为ANO1[6]。研究表明ANO1在神经细胞痛觉传导[7]、唾腺体分泌[8]、Cajal胃肠间质细胞正常慢波的形成[9]等多种生理过程中起重要作用。

近年来ANO1在肿瘤发生发展中的作用成为研究的热点，ANO1基因定位于人类染色体11q13，该区域在多种肿瘤中发生扩增[10]，ANO1蛋白在多种肿瘤中被检测到出现过表达。在头颈部鳞癌[11]及食管鳞状细胞癌[12]中ANO1出现过表达，并且是不良的预后的生物标志物。Song等[13]研究者在前列腺癌中发现敲低ANO1后肿瘤坏死因子-α（TNF-α）信号增强，进而导致磷酸化的Fas相关蛋白上调从而诱导前列腺细胞凋亡。在乳腺癌中抑制ANO1顯著抑制细胞的增殖[14]，另外在胶质母细胞瘤[15]中的研究中ANO1也被证实具有促癌作用。本研究中，ANO1在胃腺癌组织中表达率显著高于正常胃黏膜（P<0.05），临床病理资料分析显示，分化程度越低的胃腺癌ANO1蛋白表达越高，笔者推测在胃腺癌中过表达的ANO1具有促进肿瘤细胞增殖的作用，与相关学者们在其他肿瘤中的研究结论类似。

由于ANO1在肿瘤组织的过表达被广泛证实，有效的和选择性的ANO1抑制剂可以为癌症治疗提供新的策略。遗传药理学研究表明抑制ANO1可以诱导细胞凋亡和促进细胞周期停滞于G1期[16]。HER2基因在乳腺癌、胃腺癌等多种恶性肿瘤中过表达，在胃腺癌中HER2蛋白阳性表达差异较大[17]，HER2扩增的胃腺癌患者应用曲妥珠单抗可以提高总缓解率、烟草患者存活时间[18]。在乳腺癌的研究中发现，ANO1与HER2成负相关，对靶向HER2的单克隆抗体曲妥珠单抗耐药的细胞表现出ANO1表达增加[19]。ANO1可能作为HER2的转录调节因子，ANO1抑制剂可以改善患者对HER2靶向治疗的敏感性甚至逆转耐药[20]。本研究结果提示，胃腺癌患者中的ANO1蛋白与HER2成显著的负相关（P<0.05），因此笔者推测在胃腺癌患者化疗药物应用上尤其是HER2阴性或曲妥珠单抗耐药中检测ANO1蛋白的表达，必要时使用ANO1的特异性抑制剂辅助治疗可能对改善患者预后有益。但对于ANO1和HER2在胃癌中的具体作用机制尚不够明确，仍需通过进一步的体内外实验来阐明具体的分子作用机制。

綜上所述，本研究在胃腺癌组织中证实ANO1的异常表达与胃癌的发生关系密切，因此病理诊断时检测ANO1蛋白可能对疾病诊断有益。ANO1与肿瘤分化程度、HER2蛋白成负相关，HER2蛋白阴性患者中ANO1蛋白阳性更常见，ANO1可能是胃癌治疗中的新型预后生物标志物和潜在的治疗靶标。

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（收稿日期：2018-12-04 本文編辑：任秀兰）