大白猪DQB第2外显子SNP多态性分析

韦思婷，程一飞，舒星富

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

动物识别自己、排除非己以维持机体正常生理活动和抗疾病的能力是免疫系统的核心职能。这种能力很大程度上是由主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex， MHC）基因所决定的。SLA基因系统是个高度多态的系统，它的高度多态性使它成为很好的遗传标记，且有可能作为分子标记进行辅助选择。SLA被定位于猪7号染色体着丝粒的两端，其基本结构与功能上存在差别，一般有三个主要类群，分别为：Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因。SLAⅡ类基因主要有 DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、Dpa、TAP、LMP等，遗传多态性最为丰富的区域是DR和DQ亚区，在控制机体的免疫应答与调节中DR亚区和DQ亚区起着重要作用，与猪的抗病能力息息相关[1]。杨文平等[2]采用 PC R-R FLP 法对山西白猪 SLA-DQB基因外显子 2 多态性进行分析，结果表明山西白猪 SLA-DQB 外显子 2 在 HaeⅢ酶切位点上有多态性。

1 材料

1.1 试验材料

本试验的试验动物为大白猪。取仔猪耳组织 5～6 g，放入盛有 75%乙醇的EP管中，将EP管置于冰盒中带回实验室，在-20℃冰箱冻存备用。本试验采用的是传统的苯酚-氯仿抽提法以及DNA提取试剂盒对基因组DNA进行提取，TE溶解，-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 参照根据 Shia 等[3]报道的合成 SLA-DQB 基因外显子 2 引物序列，由大连宝生物工程有限公司合成引物，扩增基因的目的片段大小约为273bp。序列为：上游引物（Primer F）：5’-CGGAATTCCCCGCAGAG GATTTCGTGTACC-3下游引物（Primer R）：5’-CCGTCGTGCCTTCCTCTAT-3’。

1.2.2 DNA混合池的构建 在所有样品中随机挑选大白猪的20个DNA样，然后进行混合。

1.2.3 PCR 扩增和产物测序 PCR扩增体系总共为20μL ：去离子水7.4μL，上、下游引物各 0.4μL，DNA 模板 0.8μL，2 × Power Taq PCRMasterMix 11μL。

PCR扩增的最佳条件为：94 ℃预变性90 s;94 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共30 个循环;72 ℃最后延伸 5 min; 4 ℃保存。扩增产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。在苏州金唯智生物科技有限公司进行PCR产物混合测序。

2 结果与分析

2.1 大白猪DQB基因第2外显子PCR扩增结果

对大白猪DQB基因第2外显子的扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，电泳检测得到的条带与目的片段大小一致约为273 bp，可用于直接测序。

图 1 大白猪SLA-DQB 基因外显子2 的PCR 产物检测

2.2 大白猪DQB基因第2外显子序列测定

大白猪DQB基因第2外显子扩增产物测序结果如图2所示，在DQB基因第2外显子上一共有18个 SNP 位点。

图2 大白猪 DQB基因外显子2序列

3 讨论

生物种群在长期的进化过程中某些个体会发生基因突变，产生复等位基因，导致生物体内合成不同类型的蛋白质。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。吴圣龙等[4]对3个江西省地方猪种 SLA-DQB 基因外显子 2 的多态性进行研究，研究表明3个猪种SLA- DQB基因外显子2多态性非常丰富。董高华等[5]采用DNA测序技术对15头野猪的SLA-DQB基因外显子2序列进行测定，结果表明野猪SLA-DQB外显子2具有较丰富的核苷酸多态性。晁哲等[6]对五指山DQB基因进行研究，结果在DQB基因组中发现4处基因突变位点。本研究采用扩增产物直接测序法来对大白猪DQB 基因第2外显子的SNP多态性进行研究，结果发现大白猪一共有18个SNP位点，表明大白猪DQB基因具有高度多态性。