5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术

王芳妹 - 钟文涛 - 王淑好 - 卢 琳 韩奉玲 -

(1. 湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410007；2. 湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙 410081；3. 湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室，湖南 长沙 410081)

致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体腹泻的食源性病源微生物。由于致泻性大肠埃希氏菌相同的基因片段内保守区很相似，检测单一基因片段特异性并不高，难以确认或排除致泻性大肠埃希氏菌感染，很容易造成漏检[1-3]。因而5种致泻性大肠埃希氏菌的检测方法的灵敏度和准确性对预防和控制由其引起的腹泻有着十分重要的作用。

在新标准(GB 4789.6—2016)发布之前采用的检测方法主要是从分离培养、生化试验鉴定、血清试验和肠毒素试验进行鉴定[4-6]，该传统检测方法简单易行、费用低，但周期长，所用的试剂和血清要求严格[7]；对于那些致病菌含量很低且生化特征与普通大肠埃希氏菌相似的病原体，很难挑出真正的目的菌，也可能因为杂菌增长速度过快不易检出目的菌。2016年发布的GB 4789.6—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》中明确要求，在常规微生物检测的基础上必须要根据分子生物学中的PCR技术进行确认试验，此方法很好地解决了传统方法中检测特异性不高，耗时较长、操作较繁琐等问题，但该方法对人员专业技术要求较高，试验试剂溴化乙啶对检验人员的身体健康危害十分严重，并且在开盖操作时会增加气溶胶污染的可能性，造成假阳性的产生，难以根除[8-10]。实时荧光定量PCR技术中的TaqMan法对目标序列具有较高的特异性，结果重复性也比较好，引物和探针的设计相对比较简单，因此该方法已广泛应用于分子生物学研究中。PCR技术的应用十分广泛，已从扩增单一基因片段的PCR，发展到同时扩增几个基因的多重荧光定量PCR[11-16]。

目前，研究致泻性大肠埃希氏菌与志贺菌等的区分或检测某几类大肠埃希氏菌的类似方法很多，如朱惠芳等[17]利用微生物法鉴定1株与志贺氏菌生化相似、抗原相同的大肠埃希氏，所用微生物法耗时耗力，人为因素干扰比较大，未根据分子方法进行确认试验，也未覆盖其他大肠埃希氏菌的检测；Youmans等[18]利用普通PCR对产肠毒素大肠杆菌进行检测，Octaviana等[19]和赵爱兰等[20]使用多重PCR方法鉴定了5类致泻性大肠埃希菌，所使用的均为普通PCR，其扩增结果需配制扩增体系繁多，并进行凝胶电泳，较为费时费力、操作较繁琐、引物特异性不高；张红宇等[21]利用Taqman多重实时PCR技术即可在同一PCR反应管内同时检出3种病原微生物，有效地解决了单基因PCR体系1次只可检测1个基因型的低效缺点，但未覆盖其他大肠埃希氏菌的检测。本研究拟在以往研究的基础上全面覆盖检测这5种致泻大肠埃希氏菌，并且采用TaqMan探针技术结合了商品化的多重普通PCR技术的方法共同验证本研究的可行性，并对4种试剂盒进行特异性、灵敏度、准确度的验证，旨在为准确高效的全面筛检5种致泻大肠埃希氏菌提供参考，提高检验质量水平。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器设备

Chelex-100提取液：宝生物工程(大连)有限公司；

DNA marker和预混合Taq PCR Master Mix(2×)：宝生物工程(大连)有限公司；

脑心浸液培养基、平板计数琼脂、肠道增菌肉汤等：北京陆桥技术股份有限公司；

引物和探针：生工生物工程(上海)股份有限公司；

5种致泻大肠埃希氏菌多重普通PCR检测试剂盒：北京卓诚惠生生物公司；

猪肉和牛奶：市售；

冷冻离心机：Fresco 17型，美国赛默飞世尔科技公司；

漩涡混匀器：MX-S型，美国赛洛捷克公司；

实时荧光定量PCR仪：7500Fast型，美国ABI公司；

凝胶成像系统：ChemiDoc XRS+型，美国伯乐公司；

试验所用标准储备菌株：美国菌株保存中心(ATCC)或中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)菌种库(见表1)。

表1 试验所用菌株

1.2 引物和探针的设计与合成

肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)的毒力基因为escV/eae、bfpB，产志贺毒素大肠杆菌(STEC)和肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的毒力基因为escV/eae、stx1、stx2A，产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)的毒力基因为lt、stIa、stIb，肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)的毒力基因为invE/ipaH，肠道聚集性大肠埃希氏菌(EAEC)的毒力基因为astA、aggR、pic(见表1)；首先在NCBI中查找出escV、bfpB、stx1、stx2A、lt、stIa、stIb、invE、astA、aggR和pic的多个genebank序列号的基因序列，通过Genbank软件和BLAST软件进行序列同源性分析，确定各毒力基因的保守区域，采用Primer Premier 5.0和DNAstar软件在各自保守区域中设计引物与探针(见表2)，将设计好的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成。

1.3 模板制备

1.3.1 菌种活化和计数 将5种致泻大肠埃希氏菌和食品中常见致病菌的标准储备菌株在BHI培养基中培养(见表1)，取1 mL培养24 h后的菌液提取核酸，另取1 mL 菌液逐级稀释至10-9，选择4个稀释度(10-6、10-7、10-8和10-9)分别吸取1 mL 在PCA平板中36 ℃培养生长2 d后计数。

表2 5种致泻大肠埃希氏毒力基因的引物和探针序列†

† F为上游引物，R为下游引物，T为探针，FAM、ROX、JOE和CY5为荧光基团，BHQ1、BHQ2和BHQ3为淬灭基团。

1.3.2 核酸提取 取1 mL已活化的菌液至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心3 min。弃上清，加入5%的Chelex-100提取液30 μL，震荡混匀，煮沸10 min后立刻放入冰上，12 000 r/min离心3 min后取上清扩增待用或放入-20 ℃冰箱备用。

1.4 实时荧光PCR扩增体系建立

根据致泻大肠埃希氏菌携带的毒力基因及其探针的荧光报告基团，设计4组反应体系对5种致泻大肠杆菌进行实时荧光PCR扩增和分型，其中1号反应体系检测EPEC、STEC、EHEC，扩增escV、bfpB、stx1和stx2A基因；2号反应体系检测EIEC，扩增ipaH和invE基因，3号反应体系检测ETEC，检测lt、stIa和stIb基因，4号反应体系检测astA、aggR和pic基因。

实时荧光PCR反应体系(25 μL)：Taq PCR Master Mix(2×) 12.5 μL、上下游引物(10-5mol)各1 μL、菌株DNA模板2 μL、ddH2O 8.5 μL；实时荧光PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。

1.5 特异性分析

取1 mL已活化的沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌菌液，按1.3.2中的方法进行提取核酸。使用本研究建立的4组实时荧光PCR扩增体系对此4种常见的食源性致病菌的基因组DNA进行检测，Ct值报告为“Undet”或无明显的“S”型扩增曲线，判定为阴性。

1.6 灵敏度分析

将已计数的5种致泻大肠埃希氏菌进行10倍梯度稀释，取1 mL稀释液，按1.3.2中的方法进行提取核酸，使用本研究建立的4组实时荧光PCR扩增体系对各梯度稀释液的核酸进行检测，当检测体系的Ct值<35.0时，有荧光信号检出，并出现典型的“S”扩增曲线，判定为阳性；当35.0≤Ct值≤40.0时，且有典型的“S”扩增曲线时，则需重复试验。再次扩增后检测体系的Ct值仍≤35.0，判定为阳性。当再次扩增后，检测体系Ct值>35.0，或无典型的扩增曲线，则判定为阴性。

1.7 与商品化PCR试剂盒对比分析

将本研究中检测为阳性的5种致泻大肠埃希氏菌使用商品化PCR试剂盒进行同步对比，分析2种方法的检测结果一致性。

1.8 大量样本验证

将本单位抽查和委托本单位检验的40例肉类、奶产品、动物腹泻物和人工污染样品，分别使用本研究建立的4组实时荧光PCR扩增体系和商品化PCR试剂盒进行同步检测，分析2种方法的检测结果，统计阳性符合率和阴性符合率。

1.9 数据分析

测得的试验数据以(X±S)来表示，以Excel进行分析。

2 结果与分析

2.1 检测5种致泻大肠埃希氏菌标准储备菌株的结果

设计大肠埃希氏的内参基因uidA的引物探针，上游引物为ACTATGCCGGGATCCATCGC，下游引物为CAACAGACGCGTGGTTACAGT，探针为ROX-GTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCT-BHQ2，按1.4 配制反应体系，ABI 7500 Fast仪器中检测，结果显示(图1)，6种致泻大肠埃希氏的标准储备菌株的内参uidA基因均有明显的“S”型扩增曲线，并且Ct值基本一致，均位于15～35[22]，说明提取的5种致泻大肠埃希氏核酸质量良好，可保障后续试验的有效性。

图1 大肠埃希氏菌内参基因uidA的扩增图谱

2.2 检测5种致泻大肠埃希氏标准储备菌株毒力基因的结果

将人工合成的12对毒力基因的引物和探针组合至4种反应体系中，对5种大肠埃希氏菌的核酸进行检测，检测结果显示(图2)：EPEC与EHEC的4种毒力基因stx1、stx2A、bfpB和escV；EAEC的3种毒力基因astA、aggR和pic；EIEC的2种毒力基因invE和ipaH；ETEC的3种毒力基因lt、stIa和stIb均有明显的“S”型扩增曲线，且Ct值均位于15～35，说明4个反应体系对5种致泻大肠埃希氏菌核酸检测效果非常好。

2.3 检测4种试剂盒的特异性试验

使用本研究建立的检测方法对常见食源性致病菌：沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特氏菌和阪崎肠杆菌的核酸进行检测，结果显示(表3)，沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特氏菌和阪崎肠杆菌中均检测为阴性，说明使用本研究建立的5种致泻大肠埃希氏菌的检测方法特异性强。大肠杆菌O157：H7血清型是EHEC一种代表菌株，其携带EHEC的毒力基因escV，表3显示escV基因的检测结果为阳性，进一步验证了本方法的有效性和特异性。

2.4 检测4种试剂盒的灵敏度试验

对不同浓度的5种致泻大肠杆菌进行检测，结果见图3和表4，肠道致病大肠埃希氏菌(EPEC)的检测范围为106～102CFU/mL，检测限102CFU/mL；产志贺毒素大肠埃希氏菌(STEC)和肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的检测范围为106～102CFU/mL，检测限102CFU/mL；产肠毒素大肠埃希氏菌(EIEC)的检测范围为106～102CFU/mL，检测限102CFU/mL肠道致病大肠埃希氏菌(ETEC)的检测范围为106～102CFU/mL，检测限102CFU/mL；肠道致病大肠埃希氏菌(EAEC)的检测108～104CFU/mL，检测限104CFU/mL，表明对5种致泻大肠埃希氏菌检测的灵敏度均较高。

将不同浓度的菌液进行扩增，4种试剂盒的扩增曲线见图3，当菌液浓度<10 CFU/mL时，escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因均无扩增曲线；当菌液浓度<102CFU/mL 时，aggR基因无扩增曲线；当菌液浓度<103CFU/mL时，astA和pic也无扩增曲线，表示此时的菌液浓度已超出了方法的检出限。因此，escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因的检出限是10 CFU/mL；aggR基因的检出限是102CFU/mL；astA和pic基因的检出限是103CFU/mL；而stx2A、ipaH和stIb基因，菌液浓度<102CFU/mL时还可观察到扩增曲线，且线形较好(见表4)。

2.5 4种试剂盒与普通PCR法的试剂盒比对试验

根据GB 4789.6—2016标准使用多重普通PCR检测

图2 5种致泻大肠埃希氏菌携带毒力基因的扩增图谱

菌株名称escVbfpBstx1stx2AipaHinvEltstIastIbastAaggRpicEPEC++----------STEC+-++--------EHEC+-++--------EIEC----++------ETEC------+++---EAEC---------+++大肠埃希氏O157:H7+-----------沙门氏菌------------副溶血性弧菌------------单增李斯特氏菌------------阪崎肠杆菌------------

† “+”表示扩增出曲线；“-”表示没有扩增出曲线。

图3 4个试剂盒在不同菌液浓度下的扩增图谱

浓度/(CFU·mL-1)escVbfpBstx1stx2AipaHinvE108//////107//18.5±0.4418.1±0.17//10616.3±0.2017.6±0.3622.1±0.5621.4±0.7216.9±0.1719.1±0.5310519.1±0.4620.4±0.7025.6±0.9624.9±0.5320.2±0.1022.3±0.4410422.8±0.6224.2±0.7829.5±0.5329.0±0.5623.7±0.4426.6±0.1710326.6±0.3029.5±0.5332.4±0.6230.3±0.2626.7±0.4629.7±0.7210231.1±0.7233.1±0.5635.8±0.8934.1±0.3629.9±0.9634.5±0.2610///35.5±0.6132.6±0.36/浓度/(CFU·mL-1)ltstIastIbastAaggRpic108///16.4±0.1019.4±0.1717.7±0.17107///19.4±0.2622.8±0.2621.0±0.6110618.7±0.3516.8±0.8716.6±0.2624.5±0.6624.0±0.5625.2±0.2610521.7±0.3520.0±0.4019.5±0.3529.1±0.1726.9±0.6929.1±0.2010425.0±0.2623.6±0.5323.2±0.2632.6±0.1728.1±0.5032.3±0.1710329.1±0.1727.4±0.6126.6±0.17/32.4±0.52/10232.1±0.3531.5±0.3631.1±0.30///10//35.1±0.17///

试剂盒对5种致泻大肠埃希氏菌致病菌进行检测，结果均为阳性(图4)，说明本研究建立的方法检测结果与GB 4789.6—2016标准中多重普通PCR检测的结果一致。根据GB 4789.6—2016标准使用多重普通PCR检测试剂盒将5种致泻大肠埃希氏菌致病菌的所有毒力基因电泳跑胶出相应的DNA条带(见图4)，在整个过程中耗时较长、操作较繁琐，也进一步验证了设计的4种试剂盒毒力基因的扩增结果与多重普通PCR检测试剂盒相一致。

2.6 对污染较严重和人工污染样品进行检测

对抽查和委托检验的肉类、奶的样品，以及动物腹泻物和人工污染样品等40份样品用人工合成的4种试剂盒法和商品化的多重普通PCR检测试剂盒分别进行检测，结果显示2种方法的结果相一致，进一步表明建立的4种试剂盒方法操作简便、特异性强、灵敏度高，具有良好的实用性。

图4 5种致泻大肠埃希氏菌多重普通PCR 检测试剂盒图谱

Figure 4 Multiple common PCR detection kits were used to detect five strains of diarrheagenicEscherichiacoli

表5 不同的方法对样品的检测结果

3 结论

本研究采用TaqMan探针技术的多重PCR技术，针对5种致泻大肠埃希氏菌的保守序列，设计并合成了相关12对特异性的毒力基因的引物与荧光探针，根据设计的条件和原理建立了4种PCR扩增试剂盒，采用四色荧光PCR技术在全封闭的扩增体系中对5种致泻大肠埃希氏菌检测，其中1号试剂盒包括EPEC 与EHEC 两种菌，2号试剂盒包括EIEC；3号试剂盒包括ETEC；4号试剂盒包括EAEC。4种试剂盒不仅可以单独检测1种致泻大肠埃希氏菌，也可以同时检测5种致泻大肠埃希氏菌，检测的灵敏度最高达到10 CFU/mL，检测范围达到108～102CFU/mL，说明该方法有较高的灵敏度；使用本研究建立的检测方法对常见食源性致病菌进行检测，结果显示常见的食源性致病菌均检测为阴性，无扩增曲线，只有5种致泻大肠埃希氏菌和大肠埃希氏O157：H7有扩增曲线，说明使用本研究建立的检测方法有较强的特异性；对抽查和委托检验的40份样品用该方法和商品化的多重普通PCR检测试剂盒分别进行检测，结果显示2种方法的结果相一致，进一步表明该方法具有较高的准确度；并且可以降低检测成本，减轻工作量，避免致癌物给工作人员带来的危害。

本研究克服了以往常规检测中选择性分离、生化鉴定和血清学鉴定中的试验周期耗时较长、操作较繁琐、人为因素干扰等造成检测结果不确定和漏检的缺点；也克服了使用普通PCR中配制扩增体系繁多、跑凝胶电泳、操作较繁琐和引物特异性不高等缺点；uidA基因为大肠埃希氏菌特异性基因[23]，可以作为初筛去除很多不含大肠埃希氏的样品。但是在使用4种试剂盒研究其特异性时，选取的食源性致病菌种类较少，涉及的菌种数量面不够广泛；使用4种试剂盒对污染较严重和人工污染样品进行检测时，对检测的样品量不够，还需再多的搜集相关样品进行检测来验证4种试剂盒的准确性，拓展它们的实用性；在多重反应中对每对引物和探针的浓度比列会对灵敏度产生影响，系统地优化反应体系，可以在增菌液中目的菌不多或者提取的核酸模板量不多的情况下，也可以很准确地检测出来，从而提高阳性检出率[24]。