SDF1/CXCR4表达情况与胃癌患者临床特征的关系

陈佳栋，罗天航，孙颢，沈浩，章盛平，薛绪潮#

1海军军医大学附属长海医院普外科，上海200433

2上海市静安区中心医院普外科，上海200040

流行病学研究结果显示，胃癌的发病率为（283～483）/10万[1]。胃癌患者的生活质量较差，生存率较低[2]。肿瘤相关蛋白表达水平的变化，可通过导致胃黏膜上皮细胞的异常病变等多种致病机制，诱发胃癌。趋化因子家族能够通过影响肿瘤细胞的生物学特征，导致肿瘤细胞的增殖调控异常等，进而加剧病情的进展速度[3-4]。C-X-C家族趋化因子受体 4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）是趋化因子家族的重要成员，CXCR4高表达可提高肿瘤细胞变形能力，以及DNA核分裂速度，进而诱发恶性肿瘤的发生[2,5]。研究显示，CXCR4高表达可调控基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF1）的表达，提高SDF1的激活程度，进而明显促进卵巢癌和乳腺癌等肿瘤的进展[6]，但关于CXCR4的表达情况与胃癌关系的相关研究较少。本研究探讨CXCR4蛋白的阳性表达率和CXCR4mRNA相对表达水平与胃癌患者临床特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2018年1月第二军医大学附属长海医院收治的胃癌患者的病理组织标本。纳入标准：①年龄≥18岁；②术后病理证实为胃腺癌；③术前无放化疗和内分泌治疗；④临床资料保存完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤的患者。依据纳入和排除标准，共纳入300例胃癌患者，其中男204例，女96例；年龄≤60岁138例，＞60岁162例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期156例，Ⅲ～Ⅳ期144例。同时选取上述300例胃癌患者的癌旁组织（距肿瘤边缘2 cm）、正常胃组织（距肿瘤边缘10 cm）作为对照。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自南京博奥生物科技公司，兔抗人（稀释浓度1∶1000～1500）、鼠抗人（稀释浓度1∶400～500）抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam上海办事处），二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）购自南京博奥生物科技公司，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）购自南京碧云天生物公司，冰冻离心机购自赛默飞世尔（上海）科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学染色法检测SDF 1和CXCR 4蛋白的阳性表达情况组织切片采用石蜡包埋，并进行连续切片，脱蜡水化后，采用H2O2室温下孵育10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，每次3～5 min。8%的蛋白粉封闭液封闭2 h，除去封闭液后，加入一抗（稀释浓度1∶1000～1500），4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗3次，每次3～5 min。加入二抗（1∶400～500），室温孵育20～30 min，PBS冲洗3次，每次3～5 min。加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的标志物，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3～5 min。滴加DAB显色剂，复染，脱水，封片。

1.3.2 RT-PCR法检测SDF 1mRNA和CXCR 4mRNA相对表达水平取300例胃癌患者胃癌组织、癌旁组织和正常胃组织标本，依据RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。加入CXCR4/SDF1基因引物甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上下游引物、0.1%DEPC溶液，使其终浓度均为20 pmol/μl，制备反应体系，实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增的条件与参数：48 ℃，45 min，94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，58℃60 s，68℃2 min共40个循环；循环完毕后68℃延伸7 min。

1.4 SDF 1和CXCR 4蛋白的阳性表达结果判定

每张切片随机观察5个高倍视野，采用半定量积分方法，评估SDF1/CXCR4蛋白的阳性表达情况：①细胞阳性率评分，阳性细胞所占比例≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；②免疫组织化学染色强度评分，无着色为0分，黄色为1分，棕黄为2分，棕褐色为3分；将细胞阳性率与染色强度评分相乘，≥4分即判定为阳性表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR 4和SDF 1蛋白的阳性表达情况

胃癌组织和癌旁组织中的CXCR蛋白阳性表达率均高于正常胃组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常胃组织、癌旁组织和胃癌组织中SDF1蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1、图1）

表1 CXCR 4和SDF 1蛋白在正常胃组织、癌旁组织和胃癌组织中的阳性表达率比较[ n（%）]

图1 正常胃组织、癌旁组织和胃癌组织中CXCR 4蛋白的阳性表达情况（免疫组织化学染色，×200）

2.2 CXCR 4 mRNA和SDF 1 mRNA的相对表达水平比较

胃癌组织和癌旁组织中的CXCR4mRNA相对表达水平均高于正常胃组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常胃组织、癌旁组织和胃癌组织中SDF1mRNA相对表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 CXCR 4 mRNA和SDF 1 mRNA在正常胃组织、癌旁组织和胃癌组织中的相对表达水平比较（± s）

表2 CXCR 4 mRNA和SDF 1 mRNA在正常胃组织、癌旁组织和胃癌组织中的相对表达水平比较（± s）

注：*与正常胃组织比较，P＜0.05

组织类型正常胃组织（n=3 0 0）癌旁组织（n=3 0 0）胃癌组织（n=3 0 0）0.6 5 5±0.1 2 1 1.1 2 0±0.2 4 4*1.1 5 1±0.2 6 7*0.6 7 3±0.1 1 3 0.6 8 4±0.1 2 0 0.6 8 1±0.1 1 9 C X C R 4 m R N A S D F 1 m R N A

2.3 不同临床特征胃癌患者CXCR 4的蛋白阳性表达率和CXCR 4 mRNA的相对表达水平

不同临床分期和淋巴结转移情况的胃癌患者胃癌组织中CXCR4蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=44.925、71.532，P＜0.01）；不同临床分期和淋巴结转移情况的胃癌患者胃癌组织中CXCR4mRNA相对表达水平比较，差异均有统计学意义（t=3.571、3.769，P＜0.01）；但不同年龄、性别、肿瘤直径和分化程度的胃癌患者胃癌组织中CXCR4蛋白阳性表达率和CXCR4mRNA相对表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中CXCR 4的蛋白阳性表达率和CXCR 4 mRNA的相对表达水平（ n=300）

3 讨论

不良的生活习惯或遗传基因的突变，均可促进胃黏膜上皮细胞的DNA损伤和遗传病变，增加胃癌的发生风险[7]。特别是长期吸烟的老龄男性患者，胃癌的发生风险可进一步升高[8]。研究显示，胃癌患者的总生存时间不足36个月，无进展生存期不足8个月[8]。免疫靶向治疗在胃癌的整体治疗中具有一定临床疗效，可促进肿瘤细胞凋亡坏死，降低胃癌患者的高肿瘤负荷，改善胃癌患者的生存预后。

CXCR4是趋化因子家族成员，可影响肿瘤细胞DNA核分裂速度，从而促进肿瘤细胞增殖，改变肿瘤细胞的黏附和浸润能力。CXCR4可结合细胞膜上的糖蛋白配体，激活肿瘤细胞内核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）或丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）信号通路，从而促进肿瘤细胞快速通过G0期，导致肿瘤细胞周期紊乱。CXCR4高表达可影响肿瘤细胞突破基底膜组织的能力，增强肿瘤细胞的扩散和转移能力[9]。研究显示，CXCR4可降低肿瘤细胞基因错配修复能力，从而提高肿瘤相关基因的激活风险[10]。研究认为，部分CXCR亚型是促进胃癌患者病情进展的重要因素[11]，但对于CXCR4蛋白和CXCR4基因水平的分析研究不足。

本研究结果显示，胃癌组织中CXCR4蛋白阳性表达率和CXCR4mRNA相对表达水平均明显上调，高于正常胃组织，表明CXCR4表达水平增高可明显促进胃癌的发生发展。这可能主要与CXCR4的以下两方面的作用有关[12-13]：①CXCR4表达水平增高可提高胃黏膜上皮细胞核分裂速度，从而明显提高上皮细胞畸变的风险；②CXCR4表达水平增高可改变胃癌细胞生物学特性，从而提高肿瘤细胞对邻近正常胃组织的浸润能力。赵艳等[14]研究结果显示，胃癌患者CXCR4蛋白的阳性表达率可平均升高40%以上，特别是在伴有明显的高肿瘤负荷表现或远期病死率较高的患者中，CXCR4蛋白的表达水平可进一步的升高。本研究结果显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移的患者中，CXCR4蛋白的表达水平可进一步升高，表明CXCR4蛋白表达水平增高，可提高胃黏膜上皮细胞黏附淋巴结的能力，促进肿瘤细胞向远处转移，从而提高临床分期[1]。本研究并未发现CXCR4蛋白或CXCR4mRNA表达与肿瘤细胞分化程度的关系，表明CXCR4的表达不会影响肿瘤细胞的分化成熟过程。但周仁森等[15]研究结果显示，胃癌患者CXCR4蛋白高表达可导致肿瘤细胞低分化或中低分化，这可能与CXCR4蛋白检测的灵敏度或胃癌患者的基础性病情差别较大有关。

综上所述，胃癌患者CXCR4蛋白和CXCR4基因的表达水平均明显上调，可能与胃癌患者临床分期及淋巴结转移有关。