黄连素与miRNA-29b-3p对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

李静，李治国，王花花，袁龙，徐洁

焦作市人民医院1消化内科，3肿瘤内科，河南焦作454150 2河南省肿瘤医院普外科，郑州450000

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第3位[1]，严重威胁人体健康。目前，手术是结直肠癌的主要治疗方法，但存在出血量多、易感染等缺点；而放疗或化疗可对患者健康组织产生不良影响[2]。黄连素又称盐酸小檗碱，可从黄连、黄檗等传统中药材中提取而来，具有止泻、降血压和抗氧化等作用[3-4]。目前，越来越多的学者开始关注黄连素的抗肿瘤作用及潜在作用机制。研究表明，黄连素能够预防肿瘤发生，对肝癌[5]、肺癌[6]、甲状腺癌[7]等肿瘤细胞增殖、迁移均有抑制作用[8]。研究显示，不同浓度的黄连素可调节甲壳质酶蛋白40（Chitinase protein 40，YKL-40）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称 AKT）-cyclin D1信号通路可使结直肠癌细胞周期阻滞在G1期并诱导细胞凋亡[9]，表明黄连素可抑制肿瘤的发生发展。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类小分子非编码RNA，由具有特征性发夹二级结构的前体加工而成，通常具有关键基因调节剂的作用[10]。研究显示，结直肠癌组织中miRNA-29b的表达水平低于癌旁组织，且其与结直肠癌的淋巴结转移和TNM分期有关，表明miRNA-29b在结直肠癌进展中发挥重要作用[11]。本研究探讨黄连素和miRNA-29b-3p对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响，分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人正常结肠上皮细胞株NCM460、人结直肠癌细胞株HCT-116和Caco-2均购自美国模式菌种收集中心；黄连素（纯度≥98%）、膜联蛋白V（AnnexinV）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自天根生化科技有限公司；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）溶液购自美国Biotrin公司。LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，7500型实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪购自美国Life Technologies公司，细胞培养箱购自美国Forma Scientific公司，β-actin、miRNA-29b-3p引物均购自北京六合华大基因科技有限公司，miRNA-NC、miRNA-29b-3p mimics、anti-miRNA-NC、anti-miRNA-29b-3p均购自上海吉玛公司，NanoDrop微量核酸测定仪、流式细胞仪均购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养方法采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2条件下培养NCM460、HCT-116和Caco-2细胞，每48 h更换1次培养基。在细胞融合度约为80%时，采用0.25%胰蛋白酶消化1 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）重悬细胞，进行细胞培养。

1.2.2 qRT-PCR法检测miRNA-29b- 3 p的相对表达量 取NCM460、HCT-116和Caco-2细胞，加入Trizol试剂提取总RNA，采用NanoDrop微量核酸测定仪检测RNA样品浓度，然后按照TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录。以逆转录产物为模板，避光配制反应体系，每个样品重复3次，置于7500型实时荧光qRT-PCR仪上扩增。以β-actin为内参，所用引物及序列如下：β-actin正向引物为5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3'，反向引物为5'-TCGGCCACATT GTGAACTTT-3'；miRNA-29b-3p 正向引物为5'-GCGTAGCACCATTTGAAATCA-3'，反向引物为5'-CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT-3'；以2-△△Ct法计算NCM460、HCT-116和Caco-2细胞以及黄连素干预48 h后HCT-116细胞中miRNA-29b-3p的相对表达量，取miRNA-29b-3p相对表达量较低（即对miRNA-29b-3p相对表达量的变化最敏感）的HCT-116细胞用于后续实验。

1.2.3 MTT法检测细胞存活情况取HCT-116细胞（对miRNA-29b-3p相对表达量的变化最敏感）接种于96孔板，每孔1×105个细胞，常规培养24 h。分别加入0、25、50、100、150和200 μmol/L的黄连素，继续培养24、48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，每组设置6个复孔。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养48 h，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，每组设置6个复孔。孵育4 h，弃上清液，每孔加150 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振荡反应10 min，采用酶标仪检测每孔细胞在490 nm处的吸光度值A。将黄连素的最佳抑制浓度用于后续实验。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况取HCT-116细胞，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养，将加入150 μmol/L（最佳抑制浓度）黄连素的细胞作为治疗组，未加入黄连素的细胞作为对照组，每组均设置3个复孔，常规培养48 h。各组细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，加入PBS洗涤并重悬细胞，依次加入PI和AnnexinV-FITC溶液，室温避光反应25 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.2.5 miRNA-29b- 3 p过表达和低表达模型的建立将HCT-116细胞以适当浓度接种于6孔细胞培养板上，37℃、5%CO2培养至细胞融合度约为50%，按照脂质体LipofectamineTM2000转染试剂说明书要求的操作步骤，将过表达miRNA-29b-3p的miRNA-29b-3p模拟物（miRNA-29b-3p mimics）、低表达miRNA-29b-3p的抑制物（anti-miRNA-29b-3p）转染至HCT-116细胞，转染24 h后，更换培养基继续培养48 h，qRT-PCR检测建模成功后，用于实验。待 miRNA-NC（miRNA-29b-3P）、miRNA-29b-3p mimics转染至HCT-116细胞后，分别标记为miRNA-NC组、miRNA-29b-3p mimics组，检测转染48 h后，检测miRNA-29b-3p过表达对HCT-116细胞存活和凋亡的影响。待anti-miRNA-NC（miRNA-296-3P）、anti-miRNA-29b-3p转染至HCT-116细胞后，采用150 μmol/L的黄连素处理48 h，检测miRNA-29b-3p低表达对anti-miRNA-NC组、antimiRNA-29b-3p组HCT-116细胞存活和凋亡的影响。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-29b- 3 p相对表达量的比较

qRT-PCR检测结果显示，HCT-116细胞中miRNA-29b-3p的相对表达量为（0.20±0.05），低于Caco-2细胞的（0.32±0.04）和NCM460细胞的（1.01±0.08），差异均有统计学意义（t=3.246、14.871，P＜0.05），因此，选择结直肠癌HCT-116细胞进行后续实验。150 μmol/L黄连素处理HCT-116细胞48 h后，治疗组细胞中miRNA-29b-3p相对表达量为（1.32±0.16），明显高于对照组细胞的（0.20±0.05），差异有统计学意义（t=11.573，P＜0.01）。

2.2 不同浓度黄连素处理后细胞存活率的比较

MTT检测结果显示，不同浓度黄连素处理24、48 h后，与0 μmol/L黄连素处理的HCT-116细胞的存活率比较，采用 25、50、100、150、200 μmol/L 的黄连素处理的HCT-116细胞的存活率均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而 150 μmol/L 和200 μmol/L的黄连素处理的HCT-116细胞的存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。150 μmol/L黄连素处理48 h的HCT-116细胞的存活率低于给药24 h的存活率，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。因此，黄连素为150 μmol/L，处理48 h时，达到最佳抑制浓度。

表1 不同浓度黄连素作用于结直肠癌HCT-116细胞后细胞存活情况的比较（%，± s）

表1 不同浓度黄连素作用于结直肠癌HCT-116细胞后细胞存活情况的比较（%，± s）

注：a与0 μmol/L黄连素处理的HCT-116细胞比较，P＜0.05；b与150 μmol/L黄连素处理24 h的HCT-116细胞比较，P＜0.05

黄连素浓度（μ m o l/L）0 2 5 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 1 0 0.1 0±4.4 2 8 6.4 9±4.4 1 a 7 0.2 7±2.2 0 a 5 8.5 6±4.5 9 a 4 4.1 4±2.5 5 a 3 7.8 4±4.4 1 a 1 0 1.1 7±3.8 3 8 4.9 8±5.3 9 a 6 5.7 1±5.9 1 a 5 0.5 3±4.3 0 a 3 4.5 1±2.9 5 a b 3 7.0 3±1.6 7 a给药2 4 h 给药4 8 h

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

经150 μmol/L黄连素处理HCT-116细胞48 h后，治疗组细胞凋亡率为（17.92±2.63）%，明显高于对照组细胞的凋亡率（8.47±1.09）%，差异有统计学意义（t=5.749，P＜0.01）。（图1）

2.4 miRNA-29b- 3 p过表达对HCT-116细胞存活和凋亡情况的影响

图1 治疗组和对照组HCT-116细胞的凋亡情况

qRT-PCR检测结果显示，转染后miRNA-29b-3p mimics组细胞miRNA-29b-3p的相对表达量为（1.39±0.17），明显高于miRNA-NC组细胞中miRNA-29b-3p的相对表达量（0.20±0.07），差异有统计学意义（t=11.211，P＜0.01）。转染48 h，未经黄连素处理的HCT-116细胞存活和凋亡情况结果显示，miRNA-29b-3p mimics组HCT-116细胞存活率为（32.74±3.62）%，明显低于miRNA-NC组细胞的（98.96±5.21）%，差异有统计学意义（t=18.079，P＜0.01）；miRNA-29b-3p mimics组HCT-116细胞凋亡率为（19.80±2.31）%，明显高于miRNA-NC组的（8.23±1.14）%，差异有统计学意义（t=7.780，P＜0.01）（图2）。

图2 流式细胞仪检测miRNA-29b- 3 p过表达对HCT-116细胞凋亡的影响

2.5 miRNA-29b- 3 p低表达对HCT-116细胞存活和凋亡情况的影响

qRT-PCR检测结果显示，处理后的anti-miRNA-29b-3p组HCT-116细胞miRNA-29b-3p的相对表达量为（0.04±0.01），低于anti-miRNA-NC组细胞的（0.20±0.06），差异有统计学意义（t=4.556，P＜0.05）。经150 μmol/L黄连素处理HCT-116细胞48 h后，细胞存活和凋亡情况结果显示，anti-miRNA-29b-3p组HCT-116细胞存活率为（81.06±9.54）%，明显高于anti-miRNA-NC组细胞的（35.64±3.75）%，差异有统计学意义（t=7.675，P＜0.01）；细胞凋亡率为（8.94±0.91）%，明显低于anti-miRNANC组细胞的（16.54±1.38）%，差异有统计学意义（t=7.963，P＜0.01）。（图3）

3 讨论

图3 流式细胞仪检测miRNA-29b- 3 p低表达对HCT-116细胞凋亡的影响

黄连素从天然药用植物中提取，药理作用广泛、不良反应小，常用于治疗消化道疾病，可预防和治疗肿瘤[12]，能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡[13]。黄连素可延长食管癌细胞的细胞周期，使多数肿瘤细胞停滞在G0/G1期，抑制肿瘤细胞的增殖[14]。Park等[15]探讨黄连素对胰腺癌细胞增殖的影响，结果显示，黄连素能诱导肿瘤细胞停滞于G1期，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。Yip和Ho[16]对肝癌的研究发现，黄连素可通过上调Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）的表达水平，激活caspase 9/caspase 3途径，诱导肿瘤细胞线粒体凋亡，从而诱导肝癌细胞凋亡，起到抗癌作用。彭洪等[9]研究显示，黄连素可通过下调YKL-40-AKT-cyclin D1信号通路影响细胞周期，从而抑制细胞增殖；同时，黄连素还可抑制livin蛋白的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究采用不同浓度的黄连素分别处理HCT-116细胞 24、48 h，结果显示，150 μmol/L的黄连素处理48 h，可有效诱导HCT-116细胞凋亡。

miRNA是一类非编码小分子RNA，参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程，并调控肿瘤相关基因的表达[17]。其中，miRNA-29b能够与DNA甲基化酶的3'非翻译区特异性结合，减弱基因的甲基化水平，使抑癌基因恢复表达[18]。研究表明，miRNA-29b能够调控肿瘤相关基因，抑制肿瘤发展，发挥抑癌基因的抑癌作用[19-20]。Steele等[21]研究显示，miRNA-29b能够抑制前列腺癌细胞增殖，从而抑制前列腺癌的发生发展。此外，miRNA-29b能直接靶向结合赖氨酸去甲基化酶2A（lysine demethylase，KDM2A）抑制胃癌细胞的增殖和迁移[22]。miRNA-29b-3p是miRNA-29b的家族成员，能够抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭[23]，胶质母细胞瘤细胞过表达miRNA-29b-3p可促进肿瘤细胞凋亡[24]，表明miRNA-29b-3p在肿瘤中可能起抑制作用。本研究结果显示，治疗组细胞中miRNA-29b-3p表达水平明显高于对照组；转染48 h后，miRNA-29b-3p mimics组细胞凋亡率明显高于miRNA-NC组，表明采用黄连素处理细胞或miRNA-29b-3p过表达能抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。此外，本研究结果显示，150 μmol/L 的黄连素处理 48 h，antimiRNA-29b-3p组细胞存活率高于anti-miRNA-NC组细胞，细胞凋亡率低于anti-miRNA-NC组细胞，表明抑制miRNA-29b-3p的表达可逆转黄连素对HCT-116细胞的抑增殖和促凋亡作用。综上所述，黄连素和miRNA-29b-3p均能抑制结直肠癌HCT-116细胞的增殖并诱导其凋亡，抑制miRNA-29b-3p的表达可逆转黄连素对HCT-116细胞的抑增殖和促凋亡作用，但具体的作用机制尚需进一步深入研究。