黄蜀葵花总黄酮提取物中鞣质的含量测定

张清华，崔 燕

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic的干燥花冠。味甘，性寒，归肾、膀胱经。具有清利湿热、消肿解毒的功效。用于湿热壅遏，淋浊水肿；外治痈疽肿毒，水火烫伤[1]。黄蜀葵花在我国用药历史悠久，始载于宋代掌禹锡所著《嘉佑本草》，其后历代本草均有记载。《嘉佑本草》记载黄蜀葵花“甘、寒、滑、无毒，主治小便淋及催生，治诸恶疮、脓水久不痤者，作末敷之即愈，为疮家要药”。《本草纲目》记载：“其花气味甘、寒、滑，无毒，主治小便淋及催生，消痈肿，浸油涂汤火伤”。现代药理学研究证明，黄蜀葵花中总黄酮具明显的抗炎、抑菌、镇痛、抗病毒及促进愈合等药理作用[2-7]，并可通过抑制心肌脂质过氧化、抑制心肌炎症反应，对缺血再灌注损伤的心肌发挥保护作用[8]。

由于鞣质与黄酮类物质存在天然的生源关系，部分鞣质具有与黄酮相似的结构[9]，在黄蜀葵花总黄酮提取纯化的过程中鞣质类成分也会有所富集。目前，针对黄蜀葵花及其提取物的质量研究多集中于黄酮类成分的控制，有关黄蜀葵花总黄酮中鞣质类成分的测定迄今未见报道。根据《药品注册管理办法》中规定，药材提取的有效部位制成的制剂要求“主要成分必须基本清楚”，为此，我们对黄蜀葵花有效部位总黄酮提取物的化学成分进行了较深入的研究，建立了提取物中鞣质的含量测定方法，保证了黄蜀葵花总黄酮的质量，为其进一步研究和开发提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 8453紫外-可见分光光度计（安捷伦科技公司）；KQ2200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；XS-205电子天平（美国梅特勒-托利多公司）。

1.2 材料

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110831-200302）；黄蜀葵花总黄酮提取物（自制，批号：20090227，20090313，20091212）；干酪素，无水碳酸钠，福林酚试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品约5 mg，精密称定，置10 ml棕色量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1 ml中含没食子酸0.1 mg）。

2.1.2 供试品溶液的制备 取黄蜀葵花总黄酮提取物约10 mg，精密称定，置25 ml棕色量瓶中，加70 %乙醇约20 ml，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加70 %乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 总酚供试品溶液的制备 取上述供试品溶液4 ml，离心（7000 r/min）10 min，取上清，即得。

2.1.4 不被吸附的多酚供试品溶液的制备 精密量取上述供试品溶液20 ml，加至已盛有干酪素0.6 g的100 ml具塞锥形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

2.1.5 干酪素溶液的制备 取干酪素粉末0.6 g，置100 ml具塞锥形瓶中，加入70 %乙醇20 ml，密塞，置30 ℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

2.2 吸收波长的选择

精密量取没食子酸对照品溶液0.5 ml，总酚供试品溶液和不被吸附的多酚供试品溶液各0.2 ml，干酪素溶液0.4 ml，分别置10 ml棕色量瓶中，分别加水2 ml，福林酚试剂0.5 ml，20 %碳酸钠溶液1.5 ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置1 h。在400～900 nm波长范围内扫描，结果显示，4种反应液均在752±2 nm处有最大吸收，表明没食子酸、鞣质类成分显色后的产物有相同的吸收峰，故确定以752 nm为测定波长。

2.3 标准曲线的绘制

精密量取没食子酸对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分别置10 ml棕色量瓶中，分别加水2 ml，福林酚试剂0.5 ml，20 %碳酸钠溶液1.5 ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置1 h。以相应溶剂为空白，在波长752 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得线性回归方程为y=0.193 76x-8.6843×10-3（r=0.9996）。结果表明，没食子酸在9.76×10-4～9.76×10-3mg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密量取没食子酸对照品溶液（0.1 mg/ml）0.4 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚试剂0.5 ml，20 %碳酸钠溶液1.5 ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置1 h。以相应溶剂为空白，在波长752 nm处测定吸光度，重复测定6次，测得没食子酸吸光度的RSD为0.23 %。结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密量取总酚供试品溶液及不被吸附的多酚供试品溶液各0.2 ml，分别置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚试剂0.5 ml，20 %碳酸钠溶液1.5 ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置1 h。以相应溶剂为空白，分别于配制后室温下放置0，30，60，90，120，180 min时，在752 nm处测定吸光度，测得吸光度的RSD分别为0.52 %，0.75 %（n=6）。结果表明，显色后的总酚供试品溶液及不被吸附的多酚供试品溶液在180 min内稳定性良好。

2.6 重复性试验

2.6.1 供试品溶液的制备 取黄蜀葵花总黄酮提取物（批号20091212）约10 mg，共6份，分别精密称定，按2.1.2项方法制备供试品溶液。

2.6.2 总酚的测定 分别取上述供试品溶液4 ml，离心（7000 r/min）10 min，精密量取上清0.2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚试剂0.5 ml，20 %碳酸钠溶液1.5 ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置1 h。以相应溶剂为空白，在752 nm处测定吸光度，按没食子酸标准曲线计算总酚量。

2.6.3 不被吸附的多酚的测定 分别精密量取上述供试品溶液20 ml，加至已盛有干酪素0.6 g的100 ml具塞锥形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液0.2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚试剂0.5 ml，20 %碳酸钠溶液1.5 ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置1 h。以干酪素溶液为空白，在752 nm处测定吸光度，按没食子酸标准曲线计算不被吸附的多酚量。

2.6.4 鞣质含量计算 鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量，得样品中鞣质的平均含量为12.86 %，RSD为3.06 %（n=6）。结果表明本法具有较好的重复性。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的黄蜀葵花总黄酮提取物（鞣质含量为12.86 %）5份，各约20 mg，精密称定，置100 ml棕色量瓶中，分别加入已精密称定的没食子酸对照品约2 mg，加入70 %乙醇约70 ml，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加70 %乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按2.6.2项方法测定总酚量；按2.6.3项方法测定不被吸附的多酚量；按2.6.4项方法计算鞣质含量，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.8 3批黄蜀葵花总黄酮提取物鞣质含量测定

取3批黄蜀葵花总黄酮提取物（批号：20090227，20090313，20091212），按2.1.2项方法制备供试品溶液，按2.6.2项方法测定总酚量；按2.6.3项方法测定不被吸附的多酚量；按2.6.4项方法计算鞣质含量，3批样品的鞣质含量分别为13.03 %，14.37 %，12.58 %。

3 讨论

3.1 本研究方法测定原理为酚类物质在碱性溶液中可将福林酚试剂中的钨钼酸还原（W6+变为W5+），生产蓝色化合物，颜色的深浅与酚含量成正相关[10]。因此可采用没食子酸为对照品，福林酚试剂显色，紫外可见分光光度法测定总酚含量；用干酪素沉淀鞣质，再以福林酚试剂显色，测定不被吸附的酚类物质含量，二者之差即为鞣质含量。

3.2 药典中鞣质含量测定采用磷钼钨酸试剂[1]，本研究采用福林酚试剂代替磷钼钨酸试剂，弥补了磷钼钨酸试剂配制过程较麻烦，花费时间长，且其他还原性性物质有干扰的不足。实验结果表明，采用福林酚/干酪素法测定黄蜀葵花总黄酮中鞣质含量结果稳定，操作简便，重现性好，且具有良好的精密度和准确性，可用于黄蜀葵花总黄酮中鞣质的含量测定，保证黄蜀葵花总黄酮的质量。