丹艾痛经贴的提取工艺研究

宋军帅， 张文峰，甘兴华，王 欣，魏永利，李克明

（1.乳山市人民医院，山东 乳山 264500；2.郓城县中医医院，山东 郓城 274700；3.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014；4.山东省中医药研究院，山东 济南 250014）

痛经是年轻女性中最常见的妇科疾病，是指行经前或行经期出现下腹坠、胀痛、伴有腰酸或其他不适，重症者伴有四肢发冷、寒战、恶心、呕吐、晕厥等症状。

西医认为痛经的主要影响因素为：机械因素、免疫因素、遗传因素等[1-2]；中医则将痛经归属于“经行腹痛”的范畴。对于痛经的辨证分型，中医学者依据虚、实、寒、热与血气间相互交错的联系将痛经分为气滞血疲、寒湿凝滞、湿热疲阻、气血虚弱、肝肾虚损[3]。

西医在治疗上通常采用非甾体抗炎药（NSAID）、避孕药等缓解症状，不良反应多。中药治疗痛经则有独到之处，但是传统的汤剂往往携带、服用不便，影响了疗效发挥。通过剂型改革，研制出多种疗效可靠、服用方便、利于携带的贴剂、冲剂、胶囊等新剂型。贴剂具有使用方便、起效迅速、作用集中、持久且副作用小等特点，成为近年临床治疗痛经的新趋势[4]。

丹艾痛经贴主要由肉桂、香附、丹参、艾叶、牡丹叶、延胡索、乌药等7味中药组成，处方中肉桂、香附、艾叶均含有挥发油，为活性成分之一。传统的挥发油提取通常采用水蒸气蒸馏或有机溶剂提取，这些方法提取的挥发油有出油率低、对热不稳定组分易分解，及有机溶剂残留等缺点，而CO2超临界提取则克服了传统方法的缺点。因其提取温度低，可显著提高热不稳定性挥发油得率；根据以往提取挥发油经验，传统挥发油提取时间至少约10 h，且部分药材提取并不完全，提取周期过长，超临界CO2提取约3 h基本提取完全，极大地提高了提取效率。本实验对处方中的中药进行提取优化，再以聚丙烯酸钠为骨架材料，加入其他基质制成贴剂，可随时贴敷和停用，起效迅速且副作用小。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；Ultimate 3000紫外检测器（美国Thermo公司）；Chromeleon7工作站；色谱柱：Lichrospher C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司）；HH-4数显电子恒温水浴锅（常州博远实验分析仪器厂）；BP211Dsartorius电子天平，FA2004B型电子天平（上海安亭电子仪器厂）。

1.2 试药

丹参酮ⅡA对照品（批号110766-201721，供含量测定用）；丹酚酸B对照品（111562-201716，供含量测定用）以上对照品均购于中国食品药品检定研究院。蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；试剂：甲醇、乙醇、甲酸、乙腈为分析纯其余均为色谱纯。

2 超临界CO2提取挥发油[5-8]

以提取温度、压力、CO2流量为变量，设计L9(34)正交试验。通过以挥发油得率为指标，考察各因素对提取效果的影响。以肉桂挥发油提取为例，结果见表1。

表1 因素水平

表2 正交实验结果

综合分析肉桂正交试验结果，得最佳提取工艺为：提取温度40 ℃、提取压力35 MPa、CO2流量30 kg/h。按此最佳工艺条件验证试验后的肉桂油平均得率为6.05 %。同时比较使用传统水蒸气蒸馏法提取肉桂挥发油6 h，挥发油得率为1.33 %。可见超临界CO2提取肉桂得油率约是水蒸气蒸馏法的5倍。且超临界CO2提取法所获得的肉桂挥发油较常规水蒸气蒸馏法所得香味浓郁、颜色较深。

参照上述肉桂挥发油提取正交试验方法，设计香附L9(34)正交试验表[9]，得香附最佳工艺条件为温度45 ℃、提取压力30 MPa、CO2流量5.5 kg/h。以该提取条件进行验证后平均得率3.19 %。

参照上述肉桂挥发油提取正交试验，设计艾叶L9(34)正交试验表[10]得，艾叶最佳提取工艺条件为提取压力为20 MPa，提取温度为30 ℃，CO2流量24 kg/h，平行进行3组实验验证，挥发油平均得率为1.52 %。

3 丹参、牡丹叶等4味中药的提取方式考察

以丹参中丹参酮ⅡA与丹酚酸B为指标成分进行高效液相色谱法测定，确定最佳提取工艺。

3.1 单因素考察

3.1.1 提取方法[11-12]

3.1.1.1 水提取法 按处方比例称取提取挥发油后的肉桂、香附、艾叶与乌药、丹参、延胡索、牡丹叶合并加8倍量水加热回流2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，浓缩至浸膏状，70 ℃烘干。

3.1.1.2 乙醇提取法 按处方比例称取提取挥发油后的肉桂、香附、艾叶与醇提药材乌药、丹参、延胡索、牡丹叶合并加8倍量75 %乙醇加热回流3次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩至浸膏状，70 ℃烘干。

3.1.2 色谱条件 丹参酮ⅡA：柱温30℃，流速1 ml/min，流动相为甲醇-水（75:25），检测波长：270 nm。进样量5 μl。

丹酚酸B：柱温30 ℃，流速1 ml/min，流动相为乙腈-甲醇-甲酸-水（10:30:1:59）溶液，检测波长286 nm，进样量5 μl。

3.1.3 对照品溶液制备 丹参酮ⅡA：精密称取丹参酮ⅡA对照品0.59 mg于10 ml量瓶，取2 ml加甲醇稀释至5 ml量瓶，制成浓度为23.6 μg/ml丹参酮ⅡA对照品溶液。

丹酚酸B：精密称取丹酚酸B对照品1.58 mg于25 ml量瓶，加甲醇制成浓度为63.2 μg/ml丹酚酸B对照品溶液。

3.1.4 供试品溶液制备 丹参酮ⅡA：分别称取水提浸膏和醇提浸膏各约1 g，精密称定，分别置于100 ml量瓶，加入甲醇定容至100 ml，密塞，称定重量，超声处理（频率40 kHz，功率300 W）30 min，放冷，加甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液即得，平行3份。

丹酚酸B：分别称取水提浸膏和醇提浸膏各约1 g，精密称定，分别置于100 ml量瓶，加入80 %甲醇定容至100 ml，密塞，称定重量，超声处理（频率40 kHz，功率300 W）30 min，放冷，用80 %甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液即得，平行3份。

同上述供试品制备方法分别制备缺丹参空白溶液。

3.1.5 结果 丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量比较见表3。由表3可见，醇提法丹参酮ⅡA及丹酚酸B含量均高于水提法。故本实验采用乙醇提取。

表3 丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量比较

3.2 正交实验优选乙醇提取工艺

3.2.1 因素与水平 以加醇量、提取时间、提取次数为考察因素，每种因素取3个水平，选用L9(34) 正交表进行实验安排，因素水平设置见表4。

表4 因素水平

3.2.2 实验安排及结果 按处方比例称取提取挥发油后的肉桂、香附、艾叶与醇提药材乌药、丹参、延胡索、牡丹叶合并按供试品溶液的制备方法及正交试验安排表进行实验，并进行含量测定，以综合评分为指标进行统计分析。以丹参酮ⅡA和丹酚酸B的得率为评价指标，权重系数按分别为0.5来计算综合评分。综合评分Y=X1/X1max×0.5×100+X2/X2max×0.5×100，正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表5 正交实验结果

表6 方差结果分析

由分析可见，各因素影响程度依次为C＞A＞B，即提取次数＞提取时间＞加醇量；以丹参酮ⅡA得率、丹酚酸B得率为指标进行方差分析，结果显示，因素B归为误差项，C有显著影响。结合直观分析，A因素选取A2；B因素选取B3；C因素选取C3。确定最佳提取工艺为 A2B3C3。即用10倍量75 %乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。

3.2.3 验证性试验 按上述优化条件，平行操作3份验证，结果3次测定综合评分分别为：98.56，99.75，100.2，RSD为0.8515 %，表明优选醇提工艺稳定可行。

4 结果与讨论

处方中肉桂、香附、艾叶提取挥发油。提取挥发油后的药渣应加乙醇提取。由于挥发油不易分离，故采用超临界CO2法对其进行提取。影响超临界提取的主要因素有提取压力、提取温度、CO2流量等。通过L9(34)正交试验，以挥发油得率为指标，考察各因素对提取效果的影响。通过综合分析肉桂正交试验结果可得最佳工艺条件。按最佳工艺条件验证试验后的肉桂油平均得率为6.05 %，香附最佳工艺验证后平均得率为3.19 %，艾叶最佳工艺验证后平均得率为1.52 %。经超临界CO2法提取的肉桂、香附、艾叶药渣中仍然含有有效物质，应进一步提取，采用乙醇提取。影响醇提效果的因素主要为醇浓度、提取次数、提取时间，以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为指标，正交试验优选最佳醇提条件为10倍量75 %乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。

在超临界CO2提取时，根据以往预实验所知，超临界CO2提取约3 h基本可以提取完全，故本研究中，将提取时间定为3 h，不再进行考察。