兔包皮来源的上皮细胞与人来源脱细胞羊膜基质(HAAM)组织工程共同培养细胞层片的体外研究

谢雪锋 陈 刚 吴复跃 侯剑刚

(1复旦大学附属金山医院泌尿外科 上海 201508; 2上海睿泰再生医学临床应用研究院 上海 200040;3复旦大学附属华山医院泌尿外科 上海 200040)

尿道狭窄是泌尿外科临床较为常见的一类疾病,手术的治疗效果不甚理想,尤其是长段尿道狭窄。同时先天性尿道下裂、长段、超长段的尿道狭窄、闭锁等畸形或创伤疾病都存在尿道缺损,需要再造尿道,这也是医学界的治疗难题[1]。自体组织替代技术虽然广泛应用,但需要患者付出巨大手术创伤代价,仍深受质疑。最明显的不足之处在于需要额外手术来获得移植材料,住院时间延长;取材部位可能会产生疼痛、感染等一系列并发症;取材有限,患者不可避免受到二次创伤[2]。

我们的前期研究提示小块兔尿道黏膜和包皮组织利用组织工程学进行扩增培养,能得到适用于长段尿道狭窄替代手术的片状细胞层片,尤其是包皮组织来源的片状细胞层生长快,具备一定的厚度、长度和张力[3],为进一步研究组织工程尿道提供了实验基础。考虑到细胞层片在手术过程和之后的修复过程中容易破裂等因素,本研究在此基础上探讨包皮来源的上皮细胞与人来源脱细胞羊膜基质(human acellular amniotic membrane matrix,HAAM)共同培养形成细胞层片的效果,为临床尿道重建寻找理想的修复替代材料。

材 料 和 方 法

试剂和仪器 MCDB153培养基、FBS (美国Sigma公司);青霉素/链霉素溶液、CellTrackerTMCM-Dil(美国Thermofisher公司);胰蛋白酶EDTA溶液、Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS,上海源培生物科技股份有限公司);细胞培养皿、培养瓶、细胞刮棒(美国CORNING公司)。倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司);高速离心机、CO2恒温培养箱,生物安全柜(美国Thermofisher公司)。

羊膜支架制备 羊膜的选材严格遵循供体医学标准,取材获取患者知情同意。在获取健康剖腹产胎膜后,DPBS反复冲洗,钝性分离羊膜与绒毛膜组织,去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织。实验组用胰蛋白酶EDTA溶液消化新鲜羊膜上皮层的细胞,振荡、清洗制成HAAM,甘油保存,以钴60-γ射线照射灭菌(36 kGy)后备用。对照组将新鲜羊膜上皮面向上贴附在圆形细胞培养皿上,用细胞刮除器刮除羊膜上皮细胞,最后用DPBS清洗后备用(图1)。

A:General amniotic membrane;B:Acellular amniotic membrane.Hematoxylin-eosin staining ×20.

图1 人未脱细胞羊膜和脱细胞羊膜的组织形态学
Fig 1 Morphology of human general amniotic membrane and human acellular amniotic membrane

种子细胞制备 将冷冻保存的兔包皮细胞复苏,培养。用CellTrackerTMCM-Dil标记(37 ℃孵育5 min后,4 ℃孵育15 min)包皮细胞,生长至70%融合的包皮细胞以DPBS清洗2遍,加0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA的混合酶液,充分振荡消化10 min后加入终止液,然后吸入离心管中,400×g离心5 min,去除上清液,留取细胞备用。

包皮细胞接种到羊膜上 将实验组和对照组羊膜上皮面向上贴附在圆形细胞培养皿上,用克隆环压在羊膜上,将标记的包皮细胞按1×105/cm2的密度分别接种于实验组和对照组羊膜上,置于CO2恒温培养箱中,每2天换液1次,4天后吸去培养液,用DPBS洗涤去除非黏附细胞,然后将羊膜经甲醛固定、封片,行HE染色。然后通过组织学观察上皮细胞及其在两种基质上的黏附及生长情况。

拉伸强度检测 羊膜、HAAM、单纯细胞层片、羊膜+细胞层片及HAAM+细胞层片共5组进行拉力试验。将样本裁为20 mm×50 mm 大小,使用拉力机(FR-108C,上海发瑞仪器科技有限公司)进行样本拉伸检测,测试速度为10 mm/min,记录样本断裂的最大力及拉伸强度。

结 果

包皮细胞在两种羊膜基质上均能正常生长,且两种基质所构建的上皮组织学结构相似。细胞呈单层生长,成熟上皮予以均匀覆盖羊膜基质表面,活细胞示踪剂显示细胞生长良好。共同培养4天后,倒置相差显微镜显示,HAAM上和非羊膜部分的细胞生长良好;荧光显微镜显示,生长在脱细胞羊膜的包皮细胞贴附良好,排列规则,形态规整,存活更多,更有优势(图2～4)。HAAM作为基质与上皮细胞共同培养的细胞层片,力学强度优于单纯的细胞层片(表1)。

A:Control group;B:Experimental group.By inverted phase contrast microscope×100.

图2 光镜下两组羊膜支架上的包皮上皮细胞
Fig 2 Foreskin-derived epithelial cells seeded on two groups of amniotic membrane scaffolds under microscope

A:Control group;B:Experimental group.By fluorescence microscope×100.

图3 60 mm培养皿中CM-oil荧光标记的两组羊膜支架上的包皮上皮细胞
Fig 3 Foreskin-derived epithelial cells labled by CM-oil on two groups of amniotic membrane scaffolds in 60 mm dish (×100)

讨 论

尿道下裂和不同原因引起的尿道狭窄闭锁是泌尿外科常见疾病,由于缺乏理想的尿道修复替代材料,疗效往往不佳,尤其是针对超过3 cm 的长段尿道狭窄往往采用自身组织进行替代修补,而无论应用哪种手术方式,术后并发症均严重影响治疗效果[4]。处理长段尿道狭窄所面临的主要问题就是寻找理想的修复替代材料[5]。组织工程技术发展为尿道修复带来了新希望:将种子细胞在体外种植于天然的或人工合成的细胞外基质上,经过一段时间培养后,将他们移植到体内,与自身尿道及周围组织融合,以达到对受损尿道修复和重建的目的[6-7],其核心内容是建立由细胞和生物材料构成的三维结构和空间构象。我们的前期研究提示,利用组织工程学进行扩增培养尿道黏膜和包皮细胞,能获得较大面积的细胞层片,可以适用于长段尿道狭窄替代手术[3]。包皮来源的片状细胞层生长快,且具备一定的厚度、长度和张力[3],为进一步研究组织工程尿道层片提供了实验基础。但我们的后期研究提示,该细胞层片在动物实验中缺乏足够的机械强度和厚度,修复结果不甚理想。因此我们期望通过一种支架材料来增强该细胞层片的强度、厚度和生长时间,为临床提供更好的研究基础。

A:Control group;B:Experimental group.Frozen section×100.

图4 冻切片中荧光标记的两组羊膜支架上的包皮上皮细胞
Fig 4 Forskin-derived epithelial cells labled by CM-oil on two groups of amniotic membrane scaffolds in frozen section

表1 各组材料力学检测
Tab 1 Mechanics testing of different materials groups

MaterialsMax(×10-2N)Tensile Strength (MPa)General amniotic membrane232.82±0.357.92±0.65Acellular amniotic membrane152.67±0.227.35±1.75Cell sheet5.65±0.500.44±0.23General amniotic membrane +Cell sheet235.45±0.427.96±1.03Acellular amniotic membrane +Cell sheet170.67±0.317.58±0.89

相关文献认为HAAM是通过生物化学方法,去除组织中的羊膜上皮细胞和抗原成分,保留细胞羊膜基底膜与致密层组成的外基质框架,其特殊的组织结构利于细胞黏附和生长。作为一种天然的细胞外基质,良好的细胞载体材料,在脱除细胞成分后基质无免疫原性,有望在组织器官体内支撑引导种子细胞,并可负载细胞生长、增殖及分化[8]。我们把包皮细胞和羊膜共同培养后,发现无论是在HAAM还是未脱细胞的羊膜上,包皮细胞都能生长良好,可以形成具有一定韧性、厚度和适当大小的细胞层片(图2、3)。考虑到羊膜上的细胞具有异质性,而脱细胞羊膜具有以下优点:(1)良好的组织相容性;(2)生物可降解性;(3)无免疫原性;(4)多孔性和高空隙率,利于细胞的贴附和生长,诱导组织再生;(5)可塑性;(6)一定的机械强度[9]。范巨峰等[10]研究证实尿道黏膜上皮细胞在人脱细胞羊膜上共同培养后,细胞活性良好,所培养的细胞层生长效果良好。在本研究中,拉力试验显示脱细胞羊膜的力学强度是下降的,共同培养上皮细胞后,实验组力学强度也略低于对照组,但是仍然远大于单纯细胞层片,具备进行缝合操作的条件。HAAM作为培养基质,包皮上皮细胞良好生长,且机械强度优于单纯的细胞层片,为临床应用提供了实验基础。

本研究提示利用组织工程技术可以培养出单层细胞层片,在此基础上通过和HAAM共同培养可以得到更好的细胞层片。在HAAM上包皮细胞生长良好,与支架材料复合良好,并且具有良好的机械强度和较大面积的细胞层片,为今后组织工程化尿道的复合阶段研究提供了前期研究基础。