茚三酮比色法测定湘西腊肉甘氨酸含量*

邓湘波 邓湘平

1（郴州市食品药品检验检测中心，湖南郴州 423000）2（郴州市苏仙区食品药品监督管理局，湖南郴州 423000）

腊肉是一种历史悠久的中式传统肉制品。腊肉种类繁多，主要根据地域性进行分类。湖南湘西腊肉的风味、色泽是我国众多腊肉品种中比较突出的,是湖南腊肉中的优质产品，也是西部民族地区饮食文化的特色之一。

湘西腊肉因其独特的配方和工艺，形成了湘西腊肉独特的味香和口感。对于风味性食品，食品的挥发性化合物决定了香气特性并对食品的特征风味贡献最大。肉类产生芳香挥发物质的主要反应是氨基酸和还原糖之间发生美拉德反应和脂质热降解,其主要反应有:氨基酸和肽热降解、糖降解、硫胺素热降解、类脂类物质氧化作用以及不饱和脂肪酸双键断裂。研究鉴定食品的挥发性风味化合物已成为食品科技人员的重要任务。湘西腊肉作为一种典型的风味性食品，研究腊肉中氨基酸含量，对其挥发性风味成分的研究具有重要意义。

甘氨酸（Gly）又名氨基乙酸，为人体非必需氨基酸。甘氨酸是氨基酸系列中结构最简单，组成蛋白质的20 多种氨基酸中的一种。目前甘氨酸被广泛应用于医药、食品、农药等领域。在湘西腊肉中，由于其特有的加工工艺及湘西黑猪原材料，使甘氨酸在湘西腊肉中的含量远远大于其他食品。

目前，氨基酸的检测方法有很多，主要有氨基酸自动分析仪法（GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》、GB/T18654.11—2008《养殖鱼类种质检验第11 部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定》和高效液相色谱法QB/T 4356—2012《黄酒中游离氨基酸的测定》）。虽然都是国家推荐分析方法，但这些方法前处理均较繁杂，同时要求的仪器设备费用高，操作相对繁琐。本研究采用紫外分光光度计，用茚三酮比色法测定湘西腊肉中甘氨酸含量，该方法操作简单，仪器设备要求低，具有普遍的可行性。利用茚三酮在一定条件下与甘氨酸显色的原理，重点研究了溶液pH、显色剂用量、乙醇用量、加热温度、加热时间和冷却时间对茚三酮比色法定量检测甘氨酸的影响，效果较为满意，可供腊肉中甘氨酸含量检验检测提供参考。并在线性范围内建立测定标准曲线，通过分光光度法对其定量测定。

1 试验部分

1.1 试验仪器与试剂

1.1.1 试验仪器

S220 酸度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-9000S 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；ML204 电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.1.2 试验试剂

甘氨酸，优级纯；茚三酮、95%乙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，均为分析纯。

1.1.3 试验原料

从湖南湘西地区的吉首市泸溪县、花垣县、保靖县、古丈县、永顺县、龙山县等7 市县随机抽取小作坊和工厂加工的腊肉产品（主要为背部肉部分）各2 份，共计14 份样品，置于清洁塑料袋内送回试验室检测。

1.2 溶液的制备

1.2.1 甘氨酸标准溶液的制备

精密称取0.200 g 甘氨酸于烧杯中，加适量水溶解，转移至1 L 容量瓶中，定容至刻度，作标准储备液备用。

1.2.2 显色剂的制备

精密称取2.0 g 茚三酮，加入30 mL 乙醇溶液，低温加热溶解后，转移至100 mL 容量瓶中，冷却后，用乙醇定容至刻度，置于0 ℃～5 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 缓冲溶液的制备

0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：准确称取28.4 g 磷酸氢二钠，加蒸馏水溶解，转移至1 L 容量瓶中定容，备用。

0.1mol/L 柠檬酸溶液：准确称取21.01 g 柠檬酸（C6H8O7H2O)，加蒸馏水溶解，转移至1 L 容量瓶中定容，备用。

2 方法与结果

2.1 样品前处理

准确称取干燥后粉碎的样品2.0 g，置于烧杯中，加入20 mL 蒸馏水混匀，然后加入10 mL 6 mol/L 的盐酸溶液和5 g 活性炭，在沸水浴中加热水解1.0 h，然后将水解溶液转移至110 ℃±1 ℃过夜，用30 mL 热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀备用。

2.2 检测波长的选择

分别移取1 mL pH 值为6.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液于7 支25 mL 比色管，依次加入3 mL 0.2 mg/mL 的甘氨酸钠标准溶液和1.0 mL 2.0%茚三酮乙醇溶液，置入90 ℃水浴加热15 min，室温下以70%乙醇溶液定容至25 mL，放置20 min 后以空白溶液作参比测量不同波长下的吸光度，结果见下页图1。

2.3 最佳反应条件的选择

2.3.1 反应pH 的选择

图1 最大吸收波长选择

分别取2.0 mL 甘氨酸标准溶液于7 支25 mL 比色管中，管中分别加入1.0 mLpH 为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲盐溶液和2.0 mL2.0%茚三酮溶液，5 mL 乙醇溶液，于100 ℃水浴加热15 min，冷却10 min，用水定容至刻度。在568 nm 处测定不同条件下显色体系的吸光度，结果见图2。

图2 pH 对甘氨酸溶液吸光度的影响

由图2 可知，甘氨酸溶液在pH 为7.0 处有最大吸光度，即甘氨酸与茚三酮的显色反应适宜在弱酸环境下进行，这与文献报道相吻合。

2.3.2 显色剂用量的选择

分别取3.0 mL 甘氨酸标准溶液于7 支25 mL 比色管中，加入1.0 mL pH7.0 的缓冲盐溶液，5 mL乙醇溶液，分别加入1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.7 mL、2.0 mL、2.2 mL、2.5 mL2.0%茚三酮溶液于100 ℃水浴加热15 min，冷却10 min 用水定容至刻度。在568 nm处测定不同显色体系的吸光度，结果见图3。

由图3 可知，随茚三酮显色剂用量的增加，溶液的吸光度先增大后趋于平衡，在显色剂用量为2.0 mL 时溶液的吸光度接近最大值，继续增加显色剂用量，甘氨酸溶液的吸光度不再发生明显变化，从取样和节省显色剂方面考虑，确定2.0 mL 为最佳茚三酮溶液用量。

2.3.3 乙醇用量的选择

图3 显色剂用量对甘氨酸溶液吸光度的影响

分别取3.0 mL 甘氨酸标准溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH6.0 缓冲溶液，2.0 mL2.0%茚三酮溶液，分别加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL95%乙醇溶液，于100 ℃水浴加热15 min，冷却10 min，用水定容至刻度，在568 nm处测定显色体系吸光度，结果见图4。

图4 乙醇用量对甘氨酸溶液吸光度的影响

由图4 可知，随着乙醇用量的变化，溶液的吸光度先增大后减小，在用量为5 mL 时溶液的吸光度达最大，故5 mL 乙醇用量为最佳。

2.3.4 加热温度的选择

分别取3.0 mL 甘氨酸标准溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH7.0 的缓冲盐溶液，2.0 mL 2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，分别于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴加热15 min，冷却10 min，在568 nm 处测定显色体系的吸光度，结果见图5。

图5 加热温度对甘氨酸溶液吸光度的影响

由图5 可知，随着温度的升高，溶液的吸光度不断增加，为使样品反应更加充分，因此选用100 ℃作为最佳加热温度。

2.3.5 加热时间的选择

取3.0 mL 甘氨酸标准溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH7.0 的缓冲盐溶液，2.0 mL2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，分别于100 ℃水浴中，加热5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，在568 nm 处测定显色体系的吸光度，结果见图6。

图6 加热时间对甘氨酸溶液吸光度的影响

由图6 可知，加热15 min 时甘氨酸溶液达到最大吸光度。

2.3.6 冷却时间的选择

分别取3.0 mL 甘氨酸标准溶液于6 支25 mL 容量瓶中，加入1.0 mLPH7.0 的缓冲盐溶液，2.0 mL 2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，于100 ℃水浴加热15 min，分别冷却4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，在568 nm 处测定显色体系的吸光度，结果见图7。

图7 冷却时间对甘氨酸溶液吸光度的影响

由图7 可知，冷却10 min 时甘氨酸溶液有最大吸光度。

2.4 甘氨酸标准曲线的绘制

吸取2.0 mL 样品溶液及2.0 mL 不同浓度的甘氨酸系列标准溶液于比色管中，分别加入5.0 mL pH 为6.0 的缓冲盐溶液，充分摇匀后，加入2.0 mL质量浓度为2.0%的茚三酮显色液，5.0 mL 乙醇，摇匀，于沸水浴中加热15 min，冷却10 min 定容，用1.0 cm 比色皿，以零管调节零点，于波长568 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。同时做空白试验。甘氨酸标准曲线如图8 所示。

图8 甘氨酸标准曲线

由图8 可知，甘氨酸溶液质量浓度在0 μg/mL～50 μg/mL 范围内呈线性关系，其回归方程为：y=0.011 6 x+0.006 2，相关系数R2=0.999 4，空白试样质量浓度为0.14 μg/mL。

2.5 加样回收率试验

取样品溶液进行测定，在显色过程中按照样品中甘氨酸的量，按5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL3 个浓度水平，精密加入适量甘氨酸对照品溶液，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

由表1 数据可知，3 个不同添加水平的回收率分别为99.1%、99.6%、100.5%，精密度在0.3%～1.5%之间，表明该方法测定结果稳定可靠。

3 结论

选取湖南湘西地区吉首市泸溪县、花垣县、保靖县、古丈县、永顺县、龙山县等7 区县具有代表性的湘西腊肉样品，采用茚三酮比色法测定腊肉中甘氨酸含量。通过对试验前处理条件优化，得出最佳试验条件为：溶液pH=6.0，显色剂用量2.0 mL，水浴温度和时间分别为100 ℃、15 min，乙醇用量5.0 mL，冷却时间为10 min。在568 nm波长下测定样品溶液的吸光度，甘氨酸测定的线性范围在0.14 μg/mL～50 μg/mL 时，线性相关系数为0.999 4。加标回收率达99.1%～100.5%，检出限为0.14 μg/mL，测量结果的相对偏差为0.3%～1.5%（n=6）。试验结果表明，该方法具有操作简单，成本低廉，重现性稳定等特点，可用于湘西腊肉中甘氨酸含量的测定。