不同稀释液成分对绵羊精子低温保存效果的影响

施会彬，王玉琴,2*，何翁潭，吴至博，田志龙，张 才,2，赵战勤,2

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471023；2.河南省肉羊繁育工程技术研究中心，河南洛阳471003）

在动物生殖系统中，副性腺的分泌物有很重要的作用：分泌物在射精之前先排出以冲洗尿生殖道从而避免危害精子[1]；副性腺的分泌物为偏碱性，刚排出精子是弱酸性，处于“体眠”状态，精子的弱酸性在阴道中被分泌物中和后，精子会解除休眠状态，活力增加[2]；分泌物是精子天然的缓冲液，可以抵抗阴道中的酸性物质，使精子在阴道内部运输、贮存时维持较好的活性与受精能力[3]。基于这一发现，为改善精液保存效果，减少精液浪费，精液稀释液引起越来越多的关注。

目前，国内关于绵羊精液液态保存的相关报道有很多。赵晓娥等[4]、岳奎忠等[5]研究发现，在绵羊精液稀释液中添加葡萄糖、EDTA、柠檬酸钠、卵黄等物质对精液保存有着良好的效果。本实验拟对现有的绵羊精液稀释液配方进行改进，额外添加抗生素、脱脂牛奶和混合维生素，设计含有不同组分和含量外源物质的6 个稀释液配方，旨在筛选出更为经济有效、操作简单、可普遍应用的稀释液配方。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择饲养在河南省洛宁县国家肉羊洛阳试验站、外形体况及其他品种习性行为活动尤其是性行为活动（包括趴跨、射精、互动积极等）均正常的成年澳洲白绵羊4 只。采精前1 周内每只公羊开始补饲鸡蛋3 枚/d，胡萝卜适量。

1.2 实验器材及药品 实验器材包括假阴道、保温瓶，试管、热水器、全自动迈朗精子分析仪（购自南宁松景天伦生物科技有限公司），恒温水浴锅等。

药品：葡萄糖粉由金维他（福建）食品有限公司生产，脱脂牛奶为湖北黄冈伊利乳业有限责任公司生产，双蒸水，柠檬酸钠为河南千至商贸有限公司生产，维生素ADE 注射液（维生素A：50 IU/μL；维生素D：25 IU/μL；维生素E：0.04 mg/μL）购自哈尔滨中精生物科技有限公司，新鲜鸡蛋，青霉素由四川亿丰生物制剂有限公司生产，链霉素由华北制药集团动物保健品有限责任公司生产，恩诺沙星注射液（0.025 mg/μL）由山西省芮城科龙兽药有限公司生产。

1.3 配方设计 各稀释液配方中，除含有相同量的葡萄糖组分，其他物质不尽相同。与配方四稀释液相比，配方三稀释液中除不含双抗外，稀释液中其他组分与配方四相同。不同稀释液配方见表1。

1.4 精液采集及分析 选择1 只体重约50 kg、体格健壮的发情母羊作为台羊，采用常规假阴道法采集种公羊精液，选用精液云雾运动好、乳白色、无异味、畸形率5%以下、死亡率在0.10 以下、活力在0.85 以上的精液，稀释液温度为36～39℃时，分别在已清洗消毒干燥好的试管内按照稀释比1∶4 稀释。随后立刻进行相应检查，分别取活力在0.8 以上的0.8 mL 精液倒入6 个10 mL离心管中，分装到每组对应的密封管中，做好标号，用纱布包起24 个样（每组稀释液4 个重复），放入已准备好的保温箱内，4℃保存。每间隔6 h 进行1 次检测，持续检测96 h。利用全自动精子分析仪检测精子畸形率、活力（检测采用百分制表示）、速度（精子在稀释液中直线游动速度）和死亡率。

1.5 统计分析 将原始数据进行整理，制作Excel 表格，使用 SPSS 21.0 软件法进行单因素方差分析和Duncan's法进行多重比较。分析结果均以平均值±标准差方式表示，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同配方精子畸形率随时间变化结果 由表2 可知，配方四稀释液稀释后精子畸形率在18 h 之后均极显著低于其他试验组（P＜0.01）；配方一组在48 h 后始终极显著高于配方二组和配方三组（P＜0.01）；配方二组在18 h 与96 h 的精子畸形率极显著高于配方三组（P＜0.01）；配方五组在54、60、96 h 的精子畸形率极显著高于配方六组（P＜0.01）。

表1 不同稀释液配方组成成分

表2 不同配方精子畸形率随时间变化结果 %

2.2 不同配方精子死亡率随时间变化结果 由表3 可知，配方三与配方四稀释液稀释精液12 h 后的精子死亡率均低于其他试验组（P＜0.01），其中配方三组精子死亡率极显著高于配方四组（P＜0.01）；配方一组与配方二组的精子死亡率前54 h 差异不显著（P＞0.05），配方一组84 h 精子全部死亡，配方二组96 h 精子全部死亡；配方六组精子死亡率6 h 后持续高于配方五组（P＜0.01），2 个配方组90 h 精子全部死亡。

2.3 不同配方精子活力随时间变化结果 由表4 可知，配方三与配方四稀释液稀释精液6 h 后的精子活力极显著高于其他试验组（P＜0.01），其中配方四极显著高于配方三（P＜0.01）；配方二、五、六试验组的精子活力在前60 h 差异不显著（P＞0.05），60 h 以后配方二试验组的精子活力极显著低于配方五和六（P＜0.01），84 h 配方二精子活力降为0，90 h 配方五和六精子活力降为0。

2.4 不同配方精子运动速率随时间变化结果 由表5 可知，配方三稀释精液6 h 后的精子运动速率极显著低于配方四（P＜0.01）；配方五稀释6 h 后的精子运动速率低于配方六（P＜0.01），2 组90 h 的精子速率降为0；配方一组与配方二组精子速率在6、12、30、36、78 h时差异不显著（P＞0.05），配方二组其余测定时间的精子运动速率高于配方一组（P＜0.01），配方一组84 h的精子运动速率降为0，配方一、二组90 h 的精子运动速率降为0。

表3 不同配方精子死亡率随时间变化结果 %

表4 不同配方精子活力随时间变化结果 %

2.5 不同配方稀释液精液品质的比较 由图1 可知，不同配方稀释液精子畸形率随放置时间的延长逐渐增长，其中配方一的增长速度较其他试验组快，配方四的增长速度缓慢，实验结束时精子畸形率最低（图1-a）。配方六稀释液精子死亡率上升速度高于其他试验组，配方四精子死亡率上升速度最慢，且在实验结束时精子死亡率小于1（图1-b）。配方一稀释液精子活力随时间增长下降速度最快，精子活力最先降为0，配方四稀释液精子活力下降缓慢，且实验结束时精子活力大于0（图1-c）。配方五稀释液精子运动速率随时间变化下降最快，运动速率最先降为0，配方四稀释液精子运动速率下降缓慢，且实验结束时运动速率大于0（图1-d）。稀释后绵羊精液和精子形态见图2。

3 讨 论

新鲜精液射精量、活力、畸形率是精液品质检测的重要内容，这些指标反映精子质量和精子的生存能力。绵羊的精液化学组成主要包括蛋白质、糖类、脂质、酶、维生素、有机酸和无机离子。精液稀释后不仅可以扩大容积，还可以为精子代谢提供所需的能量物质[6-7]。稀释液中含有的营养物质、抗氧化剂、酶和激素等各种成分可提高精子活率、延长精子寿命。

脱脂牛奶在稀释液中是一种重要的营养剂。有研究表明，10%的脱脂牛奶用于绵羊精液稀释，5℃保存2 d后精子的活力和顶体完整率处于较高水平[8-9]。杨萍等[10]在精液的液态保存研究发现，1 月龄的山羊奶离心后可用于山羊精液的保存，与常规稀释液相比不会显著降低精子活力。本实验中稀释液配方三、四和六中含有10%的脱脂牛奶，72 h 时配方三和四的精子死亡率和精子畸形率最低。国外有报道称，由于卵黄与存在于尿道球腺的蛋黄凝固酶发生化学反应，含有卵黄的山羊精液稀释液会对精子造成损害，不利于精子存活，且在精子死亡后产生的氨化酶类等物质又能与卵黄继续作用形成过氧化物等有害物质，从而加速了精子死亡[11-12]。茆达干等[13]研究发现，稀释液中添加卵黄后缩短了波尔山羊的精液保存时间，认为卵黄对山羊精子有一定的副作用。也有学者认为，一般精液稀释液中的卵黄含量在15%～20%，可对精子起到保护作用[14]。郝永兰等[15]在研究国外的Optidyl（含卵黄）和OPTIXcell（无卵黄）2 种稀释液时发现，黑头杜泊羊适合用无卵黄的OPTIXcell、白头杜泊羊适合用有卵黄的Optidyl 进行精液的稀释及冷冻保存。因此，本实验中配方六与配方三、四都加入了脱脂奶粉，但配方六加入高浓度的卵黄可能是导致其精子死亡率和畸形率升高的直接原因。

表5 不同配方精子运动速率随时间变化结果 μm/s

图1 不同配方稀释液精液品质比较

图2 绵羊精液（左）与精子形态（右）图（10×40）

最初，精液稀释液中常用的缓冲保护剂有柠檬酸钠和磷酸二氢钠，随后人们发现Tris 及EDTA 等对于维持精液的渗透压和pH 有较为理想的效果[16-18]。但因柠檬酸钠不仅能有效控制pH 及渗透压变化，而且成本低易操作[19]，因此较为常用。本实验进行至72 h 时，配方四和六组中精子活力和精子运动速率高于配方二和五组，这可能与配方四和六稀释液中含有较高浓度的柠檬酸钠有关。

在采精过程中，由于外部环境和采精操作的影响，使得新鲜精液易受到细菌及微生物的污染。为了保证精液质量并延长精液保存时间，常在稀释液中添加一定量的抗生素。有研究表明 ，精子的运动性能随着抗生素浓度的增高呈先增强后减弱的趋势[20-21]。精子的运动性能与抗生素浓度存在密切关系[22]，因此精液稀释时应控制抗生素用量，避免损伤精子。现阶段精液稀释液中常添加的抗生素类药物有青霉素、链霉素和庆大霉素等。茆达干等[23]研究发现，在波尔山羊精液稀释液中加入恩诺沙星较青、链霉素有更好的精液保存效果。与本实验72 h 时得到的结果相似，即加有恩诺沙星的配方三和五组的精子活力高于只含有青霉素和链霉素不含恩诺沙星的配方一和二组。

维生素不仅有较强的抗氧化性而且能有效去除溶液中的氧化物，被广泛应用于精液保存中，以提高精子的受精率和存活率[24-25]。Kumar 等[26]研究表明，维生素E 可有效增强水牛鲜精、解冻精液中精子的抗氧化性。这一研究结果与陈晓英等[27]相似。赵凯[28]研究发现，在水牛精液冷冻保存稀释液中添加10-4mol/L 维生素D的效果较好。许多研究者还在不断探索维生素在精液中的应用，发现不仅维生素D 和E 可以有效保护精子免受冷打击，维生素A、维生素C 也有此效果[29]。本实验稀释液配方二、三和四不仅添加了维生素E，还加入了维生素A 和维生素D，结果表明配方二、三、四稀释液稀释72 h 时的精子畸形率及死亡率均低于其他实验组，但精子运动速率高于其他实验组。新加入的维生素A 和维生素D 可能与维生素E 发挥着同样的作用。

本实验最优稀释液配方四稀释36 h 时精子活率为0.78，而韩天龙等[30]实验中配方B 稀释液的精子活率在30 h 就已下降至0.78，对比2 组稀释液配方发现，配方四比配方B 除了多加入抗生素、脱脂牛奶和混合维生素外，柠檬酸钠用量也有所差异，这可能是导致2 组稀释液配方对精子活率产生不同效果的直接原因。当然，这也不排除澳洲白绵羊与杜泊羊之间的个体差异因素的影响。

4 结 论

本实验结果表明，每100 mL 双蒸水中添加3 g 葡萄糖粉、10 mL 脱脂牛奶、3 g 柠檬酸钠、25 μL 维生素ADE 注射液、10 mL 卵黄、10 万IU 青霉素、5 万IU 链霉素和25 μL 恩诺沙星注射液，该配方稀释后的精液48 h 后精子活率最高，可在绵羊人工授精生产中推广使用。