红外光谱分析技术测定饲料营养品质及其分子结构的研究进展

徐 淼，景寒松，杨桂芹

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866）

饲料是畜牧生产的物质基础，检测饲料的化学组成、消化特性，评估其营养价值，进而对饲料产品质量进行控制，是饲料生产过程中的重要环节。但饲料养分的利用率、消化降解和代谢特征不仅与传统动物营养学所重点关注的养分化学组成有关，而且在很大程度上还受饲料养分的理化性质、分子结构及饲料本身的组织结构等影响[1-3]。以饲料常规养分分析、消化性能评定等数据为基础，通过应用红外光谱（Infrared Reflection Spectroscopy，IRS）分析技术建立数据模型（单变量、多变量分析）的方式，可揭示饲料养分的光谱分子结构与其营养特性间的关系[4-5]。本文综述了利用IRS 技术在饲料及饲料原料营养价值评定、营养元素分子结构解析及其与营养特性相关性分析方面的研究进展，并对影响IRS 分析技术测定准确性的因素及在饲料工业领域应用前景进行了阐述，为丰富饲料营养价值评定理论与技术提供参考。

1 IRS 分析技术在饲料营养价值评估上的应用原理

样品中的分子吸收一定能量后，引起分子的振动从低能级振动状态向相邻的高能级跃迁，这种跃迁总是发生在红外光区，因此称作IRS。分子的红外吸收光谱属于带状光谱，获得IRS 的基本方式是漫反射和漫透射方式。因此，IRS 通常是以波长（nm）或波数（cm-1）为横坐标（吸收峰的位置），以反射光强度或其他随波长变化的性质（透射率或吸光度）为纵坐标，得到反映红外光与物质相互作用的图谱[6]。红外光谱根据波长区间可分为近红外（NIR：波数12 820～4 000 cm-1）、中红外（MIR：波数4 000～400 cm-1）和远红外（FIR：波数400～10 cm-1）区[7]。在饲料行业中，主要应用NIR与MIR 技术，其中，NIR 技术主要应用于饲料原料及饲料中有机成分的定量分析以及饲料原料掺假与否的定性判别，MIR 技术主要检测饲料或饲料原料中相应成分的分子结构组成，从而从分子结构和营养价值回归层面评价饲料或饲料原料的营养特性[8-10]。MIR 光谱区样品中分子的化学键可吸收红外光辐射，得出的IRS 可用于鉴别化合物的化学键类型，进而对化合物分子结构进行推测。组成不同物质（样品）的各种分子基团，如O-H、N-H、C-H、S-H 和C=O 等都有特定的吸收区域。当有机物分子受到红外光线照射时产生共振，同时光的能量一部分被吸收，通过测量其吸收光可得到极为复杂的图谱。图谱中的峰数、峰位和峰强与样品中组分的分子结构有关，因此被测饲料样品的光谱特征是多种组分吸收光谱的综合表现[3,11-12]。FIR 技术主要应用于中药学、生物化学方面，对核酸、蛋白质等进行分析[13]。目前，IRS 分析技术已成为饲料行业日常品控中较为成熟和常用的分析工具。

2 传统的饲料营养价值评定技术与IRS 分析技术

传统的饲料营养价值评定一般采用湿化学分析方法和动物试验（体内、体外）进行。湿化学分析方法是以物质的化学反应为基础测定含量，通常会破坏饲料的固有分子结构，并经常影响饲料营养评估的结果[14]；动物饲养或消化代谢试验不仅受试验条件（试验动物、试验周期和环境等）影响，而且成本高，很难在日常生产中进行测定。而IRS 分析技术能够以超高空间分辨率揭示生物组织的分子结构，为快速准确评定饲料的营养价值提供了有效工具。由表1 可知，在饲料营养价值评定方面，IRS 分析技术必须以传统方法测定的数据为基础，才能对未知样品进行预测；同时在饲料分子结构测定、检测速度等方面，IRS 技术具有传统方法没有的优势。只有二者有机结合起来，才能相得益彰。

3 利用IRS 分析技术测定饲料蛋白质的分子结构与其营养特性的关系

饲料蛋白质的分子结构特征是评价蛋白质营养价值的重要信息和依据。近些年来，应用IRS 分析技术在蛋白质饲料的品质分析、掺假溯源等方面已经进行了大量卓有成效的工作[15]。IRS 分析技术主要针对蛋白质分子振动（化学键的伸缩、扭曲和旋转等）产生的吸收光谱特征，研究蛋白质的二级结构组成[16]。蛋白质红外吸收光谱由9 个特征吸收带组成。其中，酰胺I 带（Amide-I，波数1 700～1 600 cm-1）和酰胺II 带（Amide-II，波数1 600～1 500 cm-1）是蛋白质红外吸收光谱中2 个主要功能波段[17-18]。酰胺I 带主要对与肽键（-CONH-）有关的H 键敏感，由80% 的C=O 和20% 的C-N 伸缩振动组成[19]；酰胺II 带主要由60% 的N-H 弯曲振动和40%的C-N 伸缩振动组成[17]。根据这2 个波段的吸收峰高度和面积变化，可推测临近基团或化学键的类型，进而确定蛋白质的分子结构特征信息[20]。

白明昧[11]应用傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectrometry，FTIS）仪定量分析了豆粕、鱼粉、玉米DDGS、玉米蛋白粉和天然羽毛粉中蛋白质的分子结构特征，表明了α 螺旋/β 折叠是反映饲料原料蛋白质体外消化率和溶解度的重要指标。吴鹏华[21]研究表明，DDGS 和豆粕混合饲料中蛋白质二级结构的改变与蛋白质组分和瘤胃降解特性显著相关，α-螺旋/β 折叠越高，瘤胃有效降解率越高，并且进一步证明蛋白质二级结构能够用来预测混合饲料的营养价值。王晓帆[22]对玉米青贮蛋白质的二级结构进行研究得出，玉米青贮蛋白质的酰胺带的峰高和面积、α- 螺旋和β 折叠的峰高和面积等与饲料粗蛋白质、可溶性蛋白质含量及反刍动物干物质和蛋白质有效降解率等具有显著的相关性。Yan 等[23]、Khan 等[24]和Peng 等[25]进一步研究得出，大麦的蛋白质分子结构中的酰胺I 带、酰胺Ⅱ带以及α-螺旋的峰高度与反刍动物对中性洗涤纤维的降解率也有显著的正相关关系[26]。以上研究为客观评价饲料蛋白质的营养价值和饲料蛋白质源结构优化提供了重要的理论依据。

4 利用IRS 分析技术测定饲料碳水化合物的分子结构与其营养特性的关系

碳水化合物（Carbohydrate，CHO）又称糖类，在动物饲料组成中占50%以上，因此CHO 的性质在饲料营养价值评定中占据重要位置。CHO 的IRS 吸收强度与其化学成分、分子结构、瘤胃降解动力学和可利用养分含量等营养特性密切相关。因此，CHO 在MIR 光谱区的吸收特性可用于饲料的营养价值评定[27]。

如Xin 等[28]对比了芥类双低菜粕（Carinata Meal）和菜籽粕在不同时间点的瘤胃降解残渣CHO 光谱结构特征，发现2 种饲料48 h 瘤胃降解残渣的光谱参数有很大差异。Yang 等[26]利用FTIS 技术测定了5 个品种大麦中的总CHO 和非淀粉CHO（β-葡聚糖、纤维素化合物）的分子结构，明确了大麦的CHO 分子结构特征与反刍动物蛋白质的利用率具有显著的相关性，而不是预期的CHO、淀粉的利用率。李欣新[10]研究表明，双低菜籽粕和豆粕中的CHO 特征峰的吸收强度与瘤胃干物质降解的参数存在相关性。解释了饲料CHO 的分子结构及饲料本身的组织结构（不同类型CHO 之间、CHO 与蛋白质等的结构关系）影响着饲料养分的消化吸收。

表1 传统的饲料营养价值评定技术和IRS 分析技术比较

淀粉是由D-葡萄糖单元聚合而成的多糖，是多数动物饲料的主要成分。动物对不同来源淀粉的消化性存在差异，淀粉的化学组分并不能够充分揭示其对动物的营养价值，淀粉的内部结构对营养物质的利用程度具有很大影响。IRS 可以反映组成淀粉的葡萄糖单元的分子结构特征。波数1 200～800 cm-1为淀粉特征峰区域，在此区域内包含C-O、C-C、C-H 的伸缩振动和C-OH 的弯曲振动。Yu[29]研究表明，在波数为860 cm-1和928 cm-1吸收峰区域的峰面积与饲料淀粉含量具有极显著的正相关关系（r 分别为0.94 和0.95）。Capron 等[30]指出，淀粉在波数995 cm-1区域的吸收峰面积越大，淀粉大分子羟基间的H 键作用力越强，淀粉酶的水解过程越困难。张琳[12]采用FTIS 技术测定并比较了主要能量饲料中淀粉的FTIS 特征，表明糙米和碎米淀粉在波数为860 cm-1和928 cm-1区域，IRS 吸收峰显著偏高，这与其化学成分分析结果（糙米和碎米中淀粉含量最高）相一致。

5 影响IRS 分析技术测定准确性的因素

5.1 定标样品数量、来源、成分含量与变异 需要大量样品做参考校准仪器是IRS 分析的难点。要选择有代表性的样品，即定标样品集中应包含除待测成分以外所有的背景信息。用于定标的样品数必须有足够的变异才能保证定标集的稳定性。这种差异必须是样本数足够（至少50 个样品，通常以70～150 个样品为宜）作为整体的内在反映[31]。因此，在实际应用中一般认为建立适配性较窄的模型需选择50～100 个定标样品[32]。根据样本的品种、来源，可建立不同的定标数据库。如对于棉籽粕，采集样品时除了考虑数量和成分含量、变异外，还应充分考虑品种、生长环境、加工方式、收获季节等因素[33]。IRS 对有机物最敏感，饲料中主要有机组分都具有吸收特性。与C、O、N、S 等相连的H 化学键通过拉伸或弯曲在近红外区所产生的振动是特有的，因此缺乏有机组分的化合物不能定标。对于无机物质，可以通过对样品中的有机含H 基团产生影响，使IRS 发生变化，进而实现其定性或定量分析[34]。

5.2 定标样品的物理性状 样品粉碎粒度的大小、样品分布和密度等也会对近红外预测性能产生影响[35]。由于粒度不同影响样品分布均匀性和光学表面性质，所以会导致反射光分散进而改变样品的近红外光谱信息[36]。赵佳等[37]认为，常规养分分析和近红外扫描样品粒径一致，可消除样品粒度对IRS 预测准确性的影响。因此，在实际工作中定标及被测样品采样、制样条件一致及样品混合均匀是确保IRS 预测准确性的基本条件。此外，样品的水分含量、表面颜色以及所含杂质的不同都会影响IRS 分析技术的预测效果[38]。

5.3 化学分析数据准确性 近红外模型的建立中，参比值（理化指标、有效成分指标）测定的准确性至关重要，选取最优建模参数，才能得到预测性能最佳的模型。按照一定标准的湿化学方法分析得到的参比数据的准确性也是影响NIRS 测定结果的重要原因之一[35]。褚小立等[39]研究表明，基础数据准确性越高，建立模型的预测性能越好，对未知样本的预测结果越精确。因此，对于定标和验证样品的理化值而言，其检测一定要按照国际公认的标准或国标法进行，且每个样品至少做2～3 个平行，以确保参比值的检测结果的精准无误。IRS 测定的准确性只与建立近红外预测模型所用的基准一致，即基准方法的准确性较高，才能保证IRS 测定结果的准确性。因此，定标数据库需要及时更新[40]。

5.4 近红外光谱仪的稳定性及操作环境 仪器所产生的噪音是影响测定结果稳定性的主要原因，这种噪音分为长期噪音和短期噪音。长期噪音主要因环境温度变化和原件功能衰退而产生，短期噪音主要来源于波长不稳定、检出器和输入放大器及仪器外部噪音。因此，近红外的测定一般要求在相当稳定的环境条件下进行[35]。

5.5 定标光谱范围及方法 根据每个样本中不同的光谱范围，建立不同的定标数据库。如Clark 等[34]报道，测定反刍动物饲料的消化性能宜选择波数为1 600～1 900 cm-1和2 200～2 300 cm-1。波数1 600 ～1 700 cm-1区域主要与C-H、C-N、N-H 基团有关，这主要与纤维和蛋白质结构相关，而波数2 200～ 2 300 cm-1区域主要与C-H 基团相关，而1 500 cm-1的区域主要与谷物中O-H 和N-H 基团（水、淀粉和蛋白质）相关。

6 IRS 分析技术在饲料工业领域应用的前景

近十年来，我国IRS 分析技术无论在研发还是在应用方面都取得了很大进展，并逐步向更深和更广领域推进，尤其是在饲料、药品检测和食品等领域取得了可观的经济和社会效益[39,41]。Yu 等[42]通过利用FTIS 技术展示了基于高级同步加速器的生物分析技术的潜力，用于研究基因修饰、基因沉默和热加工处理等引起的饲料养分分子结构变化的影响。胡枫竹[43]采用NIR 技术建立的氨/碱化玉米秸秆快速检测模型具有较高检测精度。我国的中、大型饲料企业也已采用IRS 技术快速或在线分析手段，对饲料原料进行按质论价收购。在保证饲料产品合格的前提下调整配方，可显著降低生产成本。随着便携式IRS 仪器的研发和使用[44]，相信IRS 分析技术在饲料生产领域的应用前景将十分广阔。

7 小 结

饲料养分的光谱分子结构是评价饲料营养价值的重要信息和依据，IRS 分析技术已经用于对饲料原料中的常规成分、氨基酸、有毒有害成分及部分可利用养分的测定，对典型饲料蛋白质与CHO 的分子结构特征进行测定，并将测得的数据信息与这些饲料的营养价值进行了相关分析。随着计算机、数理统计和化学计量学等技术的快速发展，IRS 分析技术作为一种检测手段预测饲料的营养价值在饲料生产领域将发挥更大的作用。