FZD5 在山羊妊娠早期的表达及激素调控

邢园园，张 云，崔云凤，任 杰，倪 华

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

胚胎着床是妊娠建立的关键环节，是影响繁殖效率的重要因素之一。尤其是体外操作的胚胎，着床率明显低于体内正常发育的胚胎[1]，是胚胎工程技术的瓶颈之一。山羊是重要的经济动物，关于山羊胚胎着床的机制研究具有重要的理论和实践意义。已有研究表明，Wnt-FZD（Wingless/Int1-Frizzled）信号通路在多种动物的胚胎着床过程中具有重要功能，如调控子宫内膜层重建、子宫接受态的建立和胚胎黏附等过程[2]。FZD 蛋白家族共分为10 类（FZD1-10），结构均为7 次跨膜受体。当Wnt 配体与FZD 受体结合，可以启动经典Wnt 信号通路，调节细胞增殖、分化、黏附和运动等功能[3]。现已发现FZD5 参与多种癌症的发生，FZD5 基因沉默后可减少前列腺癌细胞PC3的迁移和增殖[4]。Peterson等[5]研究表明，FZD5 受体与SFRP2（Secreted frizzled-related protein 2）结合激活Wnt/Ca2+通路，导致细胞内Ca2+释放，激活钙调神经磷酸酶/NFATC3 通路诱导内皮细胞的血管生成。Lu 等[6]研究发现，FZD5 基因敲除的小鼠妊娠第10.5 天胎盘血管生成减少，胚胎死亡。但FZD5 在反刍动物山羊围着床期子宫中的表达与作用尚不清楚。本研究检测FZD5 基因在山羊围着床期子宫中的表达情况，为后续研究Wnt-FZD 信号系统在反刍动物胚胎着床机制提供实验基础，为改进胚胎移植、克隆动物等胚胎工程技术操作提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验选择健康无疾病的未孕母羊27 只（黑龙江本地品种山羊）于黑龙江大庆银浪羊场统一饲养。山羊的发情周期一般为17～25 d，平均为21 d，发情持续1～3 d。采用公羊试情法鉴定母羊是否发情，选取稳定发情的用于后续实验。

1.2 实验动物模型

1.2.1 发情周期模型 采用公羊试情法判定山羊发情后，观察记录2 个发情周期。选取发情规律的山羊，在第3 次发情当天，记为发情第0 天（ED0）。山羊发情期ED0、ED6、ED12、ED16 宰杀后30 min 之内取出子宫，用PBS 清洗子宫表面存在的污物血迹，健康子宫组织，一部分液氮冻存，一部分固定石蜡包埋。每个时期取3只羊。

1.2.2 早期妊娠模型 选择发情规律的母山羊与公山羊配种，通过记录的交配日期和监控是否返情确定妊娠阶段。如果没有返情，则将最后1 次交配日期记录为妊娠第0 天（D0），根据日期确定妊娠所处阶段。分别于妊娠D0、D6、D16、D19、D25 处死动物，取子宫组织。将子宫体分成小块（每小块上有明显肉阜区）放于液氮中保存，每个时期取3 只羊。

1.2.3 类固醇激素处理模型 将健康母山羊的两侧卵巢切除，恢复2 个月康复后，分为 4 组进行皮下注射类固醇激素，每组 3 只。油处理组（对照）：1 mL 芝麻油/只；雌激素处理组：50 μg/（mL·只）；孕酮处理组：500 mg/（mL·只）；雌激素和孕酮共同处理组：500 mg 孕酮+50 μg 雌激素/（mL·只）。饲养 24 h 之后处死，取材方法同上。

1.3 荧光定量PCR

1.3.1 总RNA 提取及cDNA 合成 按照TRIzol®Reagent试剂说明书提取山羊子宫中总RNA，Nano Drop 2000测RNA 浓度及纯度；将得到总RNA 进行消化后Nano Drop 2000 测RNA 浓度及纯度；按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit 试剂盒说明书操作采用两步法合成第一链cDNA 并于-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物设计合成 按照Real-time PCR 引物原则，根据NCBI 提供的基因序列，用Premier 5 引物设计软件设计山羊FZD5 及内参GAPDH 引物序列。

表1 引物序列

1.3.3 荧光定量PCR 使用SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）对妊娠D6（孕体黏附起始）、D16（孕体黏附与延长）、D19（黏附稳固）的山羊子宫基因的表达情况进行荧光定量PCR。用ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪检测。反应体系为25 μL：上下游引物（10 mol/L）各1 μL，SYBR®Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free H2O 9 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s（采集信号），40 个循环。每个cDNA 样品设置3 个重复。由计算机根据扩增曲线自动分析得出Ct 值，以18S 为内参。以公式2-ΔCt计算基因的相对表达水平。利用GraphPad Prism 5 软件统计组间差异并做图。

1.4 Western blot 收集子宫组织，加入冰预冷的蛋白裂解液，用匀浆器匀浆，冰上孵育30 min 后离心取上清液进行蛋白定量。50 μg 蛋白沸水中煮5 min，上样，SDS-PAGE 电泳，电转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。转移后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。之后与Frizzled-5兔源抗体（1∶500，bs-2930R，Bioss）4℃孵育过夜。PBST 液漂洗，再加入Mouse Anti-rabbit IgG/HRP（1∶2 000，bs-0295M，Bioss）37℃孵育1 h。PBST 洗3 次后，ECL试剂盒显影。

1.5 免疫组化 子宫组织经中性福尔马林固定液固定，然后脱水和包埋，制成石蜡切片（5 μm），二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，抗原修复，加3%H2O2室温孵育以消除内源性过氧化物酶活性，PBS 洗涤后加封闭液（10%马血清）37℃封闭1 h，滴加Frizzled-5 兔源抗体（1∶50），4℃孵育过夜，PBS 洗涤后滴加Mouse Anti-rabbit IgG/HRP（1∶100）于37℃孵育1 h，PBS 洗涤后加DAB 显色、终止、苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检照相。

1.6 统计分析 根据荧光定量所得到的Ct 值，采用2-ΔCt方法进行结果处理。Western blot 结果使用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件扫描测定，重复3 次，其中FZD5 灰度值为FZD5 IOD 值与GAPDH IOD 值的比值。免疫组织化学切片用生物显微镜观察并拍照。数据采用SPSS1 9.0 软件进行单因素方差分析和显著性检验，结果用平均值± 标准误表示。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结 果

2.1 FZD5 mRNA 在妊娠山羊围着床期子宫中的表达图1 显示，FZD5 mRNA 在妊娠D6 时表达最高，随着黏附进行，D16、D19 显著低于D6 且表达规律呈下降趋势。

图1 FZD5 mRNA 在围着床期子宫中的表达

2.2 FZD5 蛋白在山羊子宫中的表达

2.2.1 FZD5 蛋白在山羊早期妊娠子宫中的表达 免疫组化结果（图2）显示，在山羊妊娠D6，FZD5 蛋白表达于子宫腔上皮、腺上皮中；在妊娠D16，FZD5 蛋白在子宫腔上皮和腺上皮中同样检测到信号且表达低于D6；在妊娠D19，FZD5 蛋白表达较低。

图2 围着床期山羊子宫组织中FZD5 蛋白的免疫组织化学染色结果（200×）

图3 FZD5 蛋白的Western blot 检测结果

Western blot 结果显示（图3-A），山羊妊娠（D6、D16、D19 和D25）子宫中均检测到FZD5 蛋白表达。在妊娠D6、D16 时FZD5 表达均高于D19 和D25（P＜0.05），D6、D16 之间差异不显著，D19 和D25 之间差异不显著。表明FZD5 在妊娠早期（D6、D16）表达高于胚胎黏附完成（D19）和胎盘发生的早期（D25），推测FZD5 蛋白参与山羊孕体着床过程。

2.2.2 FZD5 蛋白在山羊发情周期子宫中的表达 如图3-B所示，在山羊发情周期（ED0、ED6、ED12 和ED16）的子宫中均有FZD5 蛋白表达，但表达无显著差异。

2.3 FZD5 蛋白在类固醇激素处理子宫中的表达 如图3-C 所示，与Oil 处理组相比较，孕酮处理组FZD5 蛋白表达降低极显著（P＜0.01）；雌激素处理组FZD5蛋白表达下降但并不显著；雌激素和孕酮共同处理组FZD5 蛋白表达显著降低（P＜0.05）。这一结果表明，孕酮抑制FZD5 蛋白的表达，雌激素对抑制FZD5 蛋白的表达不显著。

3 讨 论

胚胎着床的方式分为侵入型和非侵入型着床，山羊属于非侵入式着床，与小鼠相比，山羊子宫内膜不进行蜕膜化且孕体与子宫腔上皮黏附，同时还伴随着孕体在子宫腔内的延长，使山羊整个黏附过程持续时间较长，所以山羊是研究胚胎黏附的良好模型。在山羊早期妊娠中，第6 天囊胚进入子宫腔并从透明带中孵出，随后孕体在子宫腔内开始延长；妊娠第14 天时，孕体开始分泌妊娠识别信号干扰素-tau（interferon-tau，IFNT），IFNT 能够阻碍黄体溶解，继续产生孕酮[7-8]。在孕酮作用下孕体延长并与子宫肉阜的上皮细胞粘附；妊娠第16～17 天，胚胎粘附广泛发生，IFNT 分泌达到峰值，在第20 天分泌水平降低；第19 天孕体与子宫肉阜处子宫内膜建立稳固黏附；随着妊娠进行，在孕体和子宫肉阜粘附处，组织增生血管发生，逐渐形成子叶状胎盘[9]。

在胚胎着床过程中，Wnt 信号转导通过直接开启和关闭大量的基因，如C-MYC、CYCLIN-D1、HOX A-10/11、环氧合酶-2（COX-2）基因等，以及与其他信号通路共同作用调节胚胎着床过程和胚胎发育[10]。Sonderegger 等[11]研究发现，重组配体Wnt3a 处理人滋养层细胞可激活Wnt/β-catenin 信号通路，引起基质金属蛋白酶2（MMP2）分泌，有助于促进滋养细胞在子宫内膜的迁移和侵袭；Carmon 等[12]研究显示，在人子宫内膜癌细胞中，高水平FZD5 与Wnt7a 结合显示激活β-catenin 经典Wnt 信号并增加上皮细胞增殖。有研究表明，FZD5 是分泌的卷曲相关蛋白（Secreted Frizzled-related Proteins，SFRPs）的受体，并通过内皮细胞中的钙调神经磷酸酶/ NFATc3 途径介导SFRP2诱导的血管生成[13]。本研究结果显示，山羊孕体黏附之前，FZD5 表达较高，提示FZD5 可能参与子宫腔上皮的增殖。胚胎伸展黏附期结束后，在妊娠第25 天，FZD5 表达上升，可能参与后续的血管发生胎盘形成过程。已有研究表明，在小鼠中胚胎着床“窗口”期子宫内膜β-catenin 蛋白表达暂时性下调或缺失，有利于促进子宫内膜上皮细胞分化来同步植入前胚胎的发育[14]。本实验结果证明在山羊胚胎黏附期，Wnt 受体FZD5 的表达也下调，FZD5 可能参与孕体与山羊子宫腔上皮的黏附过程。

孕酮能够激活和维持子宫内膜功能，是孕体生长、植入、胎盘形成以及后期发育所必需。反刍动物妊娠早期孕体分泌IFNT 阻碍黄体退化，使母体处于较高的孕酮水平。肉牛、奶牛和绵羊排卵后高浓度孕酮水平能够增加孕体长度；在牛的妊娠周期子宫中孕酮诱导子宫内环境改变，支持囊胚生长成卵形状和延伸成纤维状孕体[15-16]。孕酮通过影响子宫内膜作用于胚胎生长和孕体延长，孕酮诱导子宫上皮细胞分泌增殖因子（GRP）、葡萄糖转运蛋白（SLC5A11）、分泌型黏附蛋白（SPP1），钙/磷酸盐稳态的候选调节剂（STC1）和免疫调节因子等。这些基因进一步受到胚胎来源的IFNT 和皮质醇的刺激，导致妊娠期子宫腔液成分改变，进而影响滋养层细胞增殖和迁移，调节胎体伸长[17-18]。本实验中，孕酮处理导致山羊子宫中FZD5 蛋白表达极显著降低，孕酮可以通过调控FZD5 影响Wnt 信号通路影响妊娠的相关分子事件。

4 结 论

FZD5 蛋白定位于山羊子宫腔上皮和腺上皮中；在山羊妊娠早期过程中，胚胎黏附之前FZD5 mRNA 和蛋白表达水平较高，黏附期表达水平逐渐下降。在山羊发情周期中FZD5 蛋白表达无明显差异；孕酮下调山羊子宫中FZD5 蛋白表达。FZD5 在山羊早期妊娠子宫中的表达具有胚胎着床特异性，胚胎黏附期FZD5 下调有利于山羊黏附过程，且FZD5 蛋白表达受孕酮影响下调。本研究为山羊着床机制提供研究实验依据，为提高反刍动物的繁殖力，为提高胚胎工程操作技术的效率提供研究思路。