艾塞那肽单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

倪晓燕，杜贤宇，周乐春，程婷，储成风，沈毅，王荣海，宋礼华

艾塞那肽（exenatide）是 Exendin-4 的人工合成品，是首获批准应用于 2 型糖尿病的胰高血糖素样肽 1 受体激动剂（glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA）[1-2]。注射给药后，通过模拟胰岛素抑制胰高血糖素的分泌，减慢胃排空和减少食欲从而达到控制血糖的效果[3-10]。研究资料表明，艾塞那肽的测定方法目前主要有高效液相法[11]和 ELISA 试剂盒法。其中高效液相法主要用于艾塞那肽制剂的含量、纯度等检测；ELISA 方法灵敏度高，样品适用性广，可用于艾塞那肽血药浓度测定，但进口试剂盒价格十分昂贵，且难以获得，国产的试剂盒对样品的处理要求较高、不易获得稳定的检测结果。鉴于艾塞那肽的临床应用价值和未来的广泛使用，建立一种灵敏、适用性强的艾塞那肽含量检测方法具有十分重要的意义。

本文成功制备了艾塞那肽的单克隆抗体（McAb），并建立了检测血样中艾塞那肽含量的 ELISA 检测方法，成功用于艾塞那肽制剂的临床前药学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及细胞 6～8 周龄雌 Balb/c 小鼠和 6 周龄 SD 大鼠均由安徽安科生物工程（集团）股份有限公司动 物实验中心提供；SP2/0 骨髓瘤细胞由安徽省医学研究所 赠送。

1.1.2 试剂 艾塞那肽注射液（0.25 mg/ml）购自美国 Baxter Pharmaceutical Solutions LLC 公司；艾塞那肽由安徽安科生物工程（集团）股份有限公司生产；HAT 培养液、HT 培养液购自北京索莱宝科技有限公司；弗氏佐剂购自美国 Sigma 公司；辣根过氧化物酶（HRP）购自上海国源生物技术有限公司；牛血清白蛋白购自美国 Amresco 公司；PierceTMUnstained Protein MW Marker 购自美国 Thermo Scientific 公司；吐温 20、硫酸、辛酸、硫酸铵、TMB 等均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 艾塞那肽单克隆抗体制备

1.2.1.1 细胞株制备 取艾塞那肽与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化，分别免疫各雌鼠，每只 0.5 mg，7 d 给药1 次；42 d 从雌鼠的尾部取血，间接 ELISA 法[12]测血清滴度，将滴度最高的雌鼠用艾塞那肽免疫，每只 1 mg，3 d 后取该雌鼠的脾细胞制成细胞悬液，将得到的脾细胞悬液与 骨髓瘤细胞 SP2/0 混合，并在融合剂 PEG 的作用下进行细胞融合，间接 ELISA 法进行筛选，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，将杂交瘤细胞株分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水[13-14]。

1.2.1.2 McAb 的纯化和筛选 将腹水中的抗体采用辛 酸-硫酸铵沉淀法[15]纯化。取部分纯化后的艾塞那肽单克隆抗体，采用 HRP 分别进行标记，加入等体积甘油，冻存，然后用棋盘法[16]进行抗体筛选。具体方法为：用包被缓冲液稀释艾塞那肽 McAb，浓度为 10、5.0、2.5 μg/ml 包被酶标板，每一浓度包被 4 个纵行，每孔 100 μl，每孔均作复孔。4 ℃ 过夜，洗涤 3 次；封闭酶标板，37 ℃ 孵育 2 h，洗涤 3 次；在横行包被孔中依次加入系列倍比稀释艾塞那肽（20、2、0.2 ng/ml），各 100 μl，同时设空白对照 37 ℃ 孵育 2 h，洗涤 3 次；在每一包被浓度的一个纵行中分别加入按 1:500、1:1000、1:2000、1:4000 稀释的 HRP 标记艾塞那肽 McAb，37 ℃ 孵育 2 h，洗涤 5 次；加 TMB 显色液，37 ℃ 避光显色 10～15 min，用 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取吸光度（A）值。

1.2.1.3 杂交瘤细胞株稳定性考察 艾塞那肽 McAb 细胞株连续培养，按月检测，小鼠体内传代，按传代次数检测，分别在 3 个月、6 个月复苏检测分泌抗体能力。

1.2.2 双抗夹心 ELISA 方法的建立

1.2.2.1 双抗夹心 ELISA 检测方法 采用包被液将艾塞那肽 McAb 稀释、包被、封闭；加入待测溶液，37 ℃ 温育 2 h、洗涤 3 次；加入 HRP 标记艾塞那肽 McAb（1:1000 倍稀释），37 ℃ 温育 1 h、洗涤 3 次；加入 TMB 混合液，37 ℃ 避光，显色 15 min；加入终止液（2 mol/L 硫酸溶液）。酶标仪 450 nm 波长条件下检测吸光度值，根据吸光度值选用合适的抗体浓度和选取艾塞那肽检测的线性范围。

1.2.2.2 重复性检测[17]批内重复：用同一批制备的艾塞那肽 McAb，包被 1 块 ELISA 板，检测 6 组动物试验血样中阳性血清（百泌达注射组），每份血清设置 4 个复孔，测其A450，计算 CV 值得出批内误差。

批间重复：用同一批制备的艾塞那肽 McAb，包被 3 块 ELISA 板，在相同条件下分别在 3 块 ELISA 板内检测 6 份阳性血清，每份血清设置 4 个复孔，计算 CV 值得出批间误差。

1.2.2.3 标本检测 待测样品制备：精密称取艾塞那肽，用稀释液稀释至 0.25 g/L，作为标准品溶液备用。选用试验级 SD 大鼠（6 周龄左右）18 只，随机分为 6 组，每组 3 只；每组随机选 1 只皮下注射艾塞那肽注射液（百泌达），1 只注射等量生理盐水，另 1 只不给药，6 组动物分别进行实验，每组给药后分别按第 0、5、15、30、60、120、180、240 min 采集血样，离心取血清冻存待用。不给药的大鼠血清作为稀释血清用。按照建立的双抗夹心 ELISA 方法，对 6 组动物血清进行测定，记录吸光度值描绘药代曲线。

2 结果

2.1 检测用单抗的确定

用艾塞那肽免疫 Balb/c 小鼠 5 次后，测定血清效价，血清稀释度从 1:100 倍比稀释至 1:25600，ELISA 检测血清效价后选取血清效价为 1:25600 的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合率在 95% 以上。有限稀释法 4 次克隆后获得 5 株分泌高效价 McAb 杂交瘤细胞株（5F3、1C9、5C3、4H10 和 3D7）。棋盘法筛选出 2 株杂交瘤细胞（3D7、5F3）用于 ELISA 检测。3D7、5F3 连续培养 6 个月，小鼠体内的传代 4 次以上，液氮中保存半年后复苏，分泌抗体能力不变。纯化后 3D7、5F3 McAb 的纯度可达 90% 以上，见图1。

2.2 标准曲线的绘制

以 10 μg/ml 的 3D7 为包被抗体，HRP-5F3（即辣根过氧化物酶标记的艾塞那肽 McAb 5F3）为检测抗体，HRP-5F3 的工作浓度 1:1000 倍稀释，线性范围以艾塞那肽标准品溶液（0.25 g/L）为母液梯度稀释，结果在 0.125～16 ng/ml 范围线性较好（图2），检测限为 2 ng/ml。

图1 McAb 纯化后的 SDS-PAGE

2.3 重复性

批内重复性试验的 CV 值为 5.7%，批间重复性试验的 CV 值为 7.6%，说明本研究建立的方法具有较好的重复性和稳定性。

2.4 标本检测结果

采用建立的双抗夹心 ELISA 方法，对 6 组动物血清进行测定，结果基本一致，各时间点A值取平均值后绘制A值-时间曲线（图3）。百泌达组在注射 5～30 min 后血样A值会达到波峰，注射 180 min 后A值与生理盐水组的A值数值趋向一致。

3 讨论

研究获得了分泌高效价 McAb 的杂交瘤细胞株，经纯化、筛选后，McAb 纯度大于 90%，液氮保存 6 个月，分泌抗体能力不变，证明制备方法可行。所建立的艾塞那肽含量双抗夹心 ELISA 方法灵敏度高、重复性好，经过样本检测验证，此方法可用于药代实验中动物血样的检测。

双抗夹心法的关键在于获得包被抗体与酶标抗体的最佳配伍，研究中以 3D7 为包被抗体，以 HRP-5F3 为检测抗体，一系列稀释后加入已知的不同浓度艾塞那肽标准品，选择空白组A值较小，且A值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳检测工作浓度（3D7 包被浓度 10 μg/ml，HRP-5F3 的工作浓度 1:1000 倍稀释为最佳 配伍）。

图2 艾塞那肽 ELISA 检测方法的标准曲线

图3 动物药代实验血样测定结果

血样样本检测中，除了文中涉及的研究之外，项目组还对不同稀释液稀释艾塞那肽标准品可能产生的差异进行了研究。分别采用 PBS 稀释和大鼠血清稀释艾塞那肽标准品至不同浓度，记录A值并绘制标准曲线。结果显示，大鼠血清稀释的A值会降低，但也具有良好的线性关系。因此，本研究建立的方法既可以检测血清中艾塞那肽的含量，也可以检测药物制剂中艾塞那肽的含量，但在检测不同样本时，应注意采用相同样品稀释液。