脆性X综合征国家参考品的研制

高飞，胡泽斌，游延军，蒲小聪，陈蕊，黄杰

脆性 X 综合征（fragile X syndrome，FXS）是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最常见的单基因病[1]，95% 以上的脆性 X 综合征患者是由于FMR1 基因 5' 非编码区 CGG 重复序列扩增导致 Fmrp 表达沉默所致[2]，CGG 重复在人群中具有高度多态性，正常型的重复次数为 6～44，FMR1基因表达正常，无明显临床表现。中间型的重复次数为 45～54，子代可扩增为前突变，无明显临床表现。CGG 重复数突变至 55～200 的个体称为前突变携带者（premutation，PM），全突变（full mutation，FM）重复 次数大于 200[3]，临床表现明显。1995年至今，我国共对 12 676 例智力低下患儿进行了脆性 X 综合征的筛查，查出患儿共计 804 例，以此计算出脆性 X 综合征在我国智力低下患儿中的患病率约为 6.3%[4]。2006年国内共对 850 例孤独症谱系障碍患儿进行筛查，检出 19 例脆性 X 综合征患儿，估算出脆性 X 综合征在孤独症谱系障碍中的患病率约为 2.2%[5]。

目前，国内外许多厂家已开发脆性 X 综合征检测试剂盒，用以检测患者的FMR1 基因 CGG 突变型别，由于方法不同[6]，其特异性和灵敏度存在差别。因此，有必要研制脆性 X 定性参考品使检测规范化。

1 材料与方法

1.1 材料

核酸提取试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；脆性 X 参考品研制所需的细胞系包含的基因型别：中间型（CGG 重复 45～54）、前突变型（CGG 重复 55～200）、全突变型（CGG 重复 ＞ 200）、嵌合型（前突变与全突变嵌合存在）、嵌合型（野生与前突变嵌合存在）、罕见FMR1 基因缺失型及 6 个野生型（正常人样本）均购自中南大学医学遗传学重点实验室；阴性参考品研制所需原料为收集其他病原体感染的细胞；参考品验证所需试剂盒购自广州市达瑞生物技术股份有限公司和北京贝瑞和康生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 参考品原料的制备 当天采集患者 5～10 ml 新鲜血液样品，使用一次性枸橼酸钠抗凝采血管保存，低温保存运输至实验室。在无菌环境中，提取患者的外周血单核淋巴细胞，加入病毒液制备完全转化液，进行细胞转化与细胞培养、冻存。建立细胞系后进行种子细胞系扩大培养。用核酸提取试剂盒对各型别细胞系进行 DNA 抽提，用 NanoDorp 测定OD260/OD280和OD260/OD230值和琼脂糖凝胶电泳胶检验 DNA 的完整性，NanoDropTMOne 对 DNA 进行精确 定量。阳性参考品为：中间型、前突变型、全突变型、嵌合型（前突变与全突变嵌合存在）、嵌合型（野生与前突变嵌合存在），阴性参考品原料的来源为收集其他非人源性大肠杆菌，提取核酸，与罕见FMR1 基因缺失型及 6 个野生型组成阴性参考品。

1.2.2 参考品原料的验证 由中国食品药品检定研究院体外诊断试剂所非传染病诊断试剂室对参考品所包含的阳性及阴性样本的 DNA 进行浓度测定。同时，将全部样本送中南大学医学遗传学重点实验室进行毛细管电泳及 DNA 片段分析。

1.2.3 参考品盘的制备 将 21 个样本的基因组 DNA 溶液稀释至 50 ng/μl 的浓度，然后将稀释后的 DNA 溶液分装在 0.5 ml 的冻存管中。每套参考品盘包含 21 个样本，其中，阳性样本包括：2 种中间型样本（CGG 重复 45～54）、4 种前突变型（CGG 重复 55～200）、4 种全突变型（CGG 重复 ＞ 200）、1 种嵌合型（前突变与全突变嵌合存在）、1 种嵌合型（野生与前突变嵌合存在），阴性样本 包括：1 种罕见FMR1 基因缺失型及 6 种野生型样本、 2 种非人源样本（大肠杆菌核酸样本）。参考品盘放置于 -80 ℃ 保存。

1.2.4 参考品盘的分装后验证 采用由北京贝瑞和康生物技术有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 检测试剂盒对分装参考品进行验证。检测结果与样本信息 一致。

1.2.5 不同公司对参考品盘的验证 选择 4 家脆性 X 综合征检测试剂盒检测、生产或代理机构对本参考品进行验证。此 4 家单位生产的试剂的检测方法包括：PCR-荧光法、DNA 片段分析法、毛细管电泳法等。验证的项目包括以下几个方面：①准确性（阳性符合率）：检测试剂盒检测范围内脆性 X 不同型别国家参考品；②特异性：检测 9 份阴性参考品。

1.2.6 参考品稳定性验证 将参考品反复冻融 3 次后，采用广州市达瑞生物技术股份有限公司提供的脆性 X 综合征FMR1 基因检测试剂盒（荧光 PCR 毛细管电泳法）进行稳定性验证。

2 结果

2.1 参考品原料的验证结果

将参考品所包含的阳性及阴性 DNA 样本送中南大学医学遗传学重点实验室进行毛细管电泳及 DNA 片段分析。用 GeneMapper 软件进行结果分析，分析结果显示全部阳性样本及 1 种罕见FMR1 基因缺失型及 6 种野生 型样本的碱基序列与样本 CGG 重复数一致。检测结果见 图1、表1。

2.2 参考品盘的分装后验证结果

图1 样本毛细管电泳验证结果

表1 样本基因片段分析验证结果

图2 AmplideXTM FMR1 PCR/CE Reagents 检测试剂盒对分装参考品的验证结果

采用北京贝瑞和康生物技术有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 检测试剂盒对分装参考品进行验证。验证结果显示参考品盘中的 P1、P2 样本为脆性 X 综合征FMR1 基因中间型样本 CGG 重复数分别为 46/Y、54/Y，P3～P6 为脆性 X 综合征FMR1 基因前突变型样本，CGG 重复数分别为：30/69、29/155、56/Y、100/Y，P7～P10 为脆性 X 综合征FMR1 基因全突变型样 本，CGG 重复数分别为：30/ ＞ 200、29/ ＞ 200、＞ 200/Y、＞ 200/Y，P11 为脆性 X 综合征FMR1 基因前突变和全突变嵌合型样本，CGG 重复数为：86 ＞ 200/Y，P12 为脆性 X 综合征FMR1 基因野生和全突变嵌合型样本，CGG 重复数为：13 ＞ 200/Y，N1～N6 为FMR1 基因野生型样本，CGG 重复数分别为：29/29、31/36、29/30、30/34、30/Y、36/Y，N7～N8 为非人源性基因组 DNA 样本，N9 为FMR1 基因缺失样本，验证结果见图2。

2.3 不同公司对参考品盘的验证

4 家脆性 X 综合征检测试剂盒检测、生产或代理机构用其自行生产或代理的脆性 X 综合征检测试剂盒对本参考品进行验证。验证结果表明参考品的组成成分合格，验证结果见表2。

表2 4 家公司对本参考品盘验证结果

表3 参考品的稳定性验证结果

2.4 参考品的稳定性验证结果

将参考品反复冻融 3 次后，采用北京贝瑞和康生物技术有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 检测试剂盒进行稳定性验证。验证结果表明反复冻融对本参考品的稳定性没有影响，如表3所示。

3 讨论

目前脆性 X 的基因诊断技术主要有 PCR、Southern blot、DNA 片段分析、BSP-测序等方法，已广泛应用于国内外各大医院和临检机构进行临床诊断。然而目前在脆性 XFMR1 基因检测中，无论中间型、前突变还是全突变脆性 X 突变型别，国内外都缺乏统一认可的国家参考品。脆性 X 综合征国家参考品涵盖了国内常见脆性 X 突变型别和国内已发现但频率低于 1% 的部分低频型别样本。通过对脆性 X 综合征国家参考品的验证，结果表明参考品性质稳定，可以为临床实验室质量评价提供可靠的参考物质，可用于国内大多数试剂盒的性能评价要求。因此，该参考品盘能基本满足不同试剂盒的评价。根据美国国家脆性 X 基金会的研究，脆性 XFMR1 基因型别包含：野生型、中间型、前突变型、全突变型和嵌合型，本研究建立了包含全部 5 种不同型别的脆性 X 综合征国家参考品，为临床实验室质量评价及相关试剂盒的研发提供了可靠的质控物质。