安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究

朱安祥 ,朱瑞奇 ,吴 韩 ,曾杨梅 ,吴俊伟,

(1.西南大学动物科学学院,重庆荣昌402460 ;2.重庆布尔动物药业有限公司,重庆荣昌 402460)

近年来,由于抗微生物药物的滥用,抗生素耐药性已成为本世纪公共卫生的主要威胁,兽医临床上的细菌耐药性问题也遍布全球[1]。交叉耐药、多重耐药等问题的出现为临床各类疾病的预防和治疗带来愈加严峻的挑战。安妥沙星是我国首个自主研发的喹诺酮类新药,2009 年批准上市,具有良好的体内外抗菌能力和安全性,目前主要用于人医临床上大肠埃希菌引起的急性肾盂肾炎和膀胱炎,随着宠物在家庭中地位的提高,该药今后有望开发为宠物药品。大肠埃希菌多重耐药的产生主要与其外排泵系统有关,已有的试验数据、研究结果提示,外排泵AcrAB-TolC 是导致其产生耐药最主要的药物外排泵[2]。

本试验用安妥沙星诱导大肠埃希菌标准菌株ATCC25922,对诱导前后菌株进行最小抑菌浓度(MIC)测定,并通过对诱导前后菌株的外排泵AcrAB-TolC 调控基因acrA、acrB、tolC、acrZ的序列及mRNA 表达量进行分析,以期为该细菌在以AcrAB-TolC 为中心的外排系统介导的大肠埃希菌多重耐药、分子生物学等方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种 大肠埃希菌ATCC25922,购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂 安妥沙星,购自中国食品药品检定研究院;乳酸环丙沙星、恩诺沙星,购自上虞京新药业有限公司;盐酸土霉素,购自河北建民淀粉糖业有限公司;硫酸黏菌素,购自河北圣雪大成唐山制药有限责任公司;硫酸庆大霉素,购自烟台只楚药业有限公司;磺胺嘧啶,购自西南合成制药股份有限公司;LB 肉汤培养基、LB 琼脂培养基、MH 肉汤培养基、MH 琼脂等培养基,均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;Pfu PCR Master Mix(KP201),购自天根生化科技(北京)有限公司;琼脂糖、UNIQ-10柱式总RNA 抽提试剂盒,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;GoScriptTMReverse Transcription System 反转录试剂盒、TaKaRa SYBR’ 100179;Premix ExTaqTMII(Tli RNase H Plus)定量试剂盒,购自普洛麦格生物技术有限公司。

1.3 测定最小抑菌浓度(MIC)

1.3.1 复苏标准菌株ATCC25922 将标准菌株ATCC25922 从-80 ℃冰箱取出,37 ℃水浴3 -4 min,待菌株融化后,用微量移液器吸取5 μL 于LB 肉汤中,置于37 ℃培养18 -24 h,次日接种到LB 琼脂平板上,置于37 ℃培养18 -24 h,备用。

1.3.2 微量肉汤稀释法测定MIC 按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)提供的兽医版药敏试验标准(VET01-A4)[3],采用微量肉汤稀释法测定所有抗菌药对ATCC25922 的最小抑菌浓度(MIC)。

1.3.3 体外诱导大肠埃希菌 根据1.3.2 测定的安妥沙星的MIC,参照张静等[4]的方法以1/2 ×MIC浓度的安妥沙星为起点体外诱导标准菌株,获得耐药性稳定的菌株A。测定安妥沙星和其他药物对诱导前后细菌的MIC,方法同1.3.2。

1.4 诱导前后菌株外排泵AcrAB-TolC 基因突变情况

1.4.1 引物设计 根据GenBank 中大肠埃希菌相应基因序列设计PCR 扩增引物,acrB由于序列较长,将其分为2 段设计2 对引物分别扩增,见表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以大肠埃希菌DNA 为模板,进行PCR 扩增,电泳检测后将产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4.2 诱导前后细菌acrA、acrB、tolC和acrZ序列的变异情况 将细菌培养至生长对数期,以浓度约为3.0 ×108CFU/mL 的新鲜菌液为模板,用合成的引物利用PCR 技术扩增相应基因,反应体系如表2所示。各基因的PCR 反应程序:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,退火温度见表1,时间30 s,72 ℃延伸2 min,共30 个循环,最后72 ℃温育5 min。PCR反应结束后,用1.5%的琼脂糖凝胶检测扩增产物,将符合要求的PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 诱导前后细菌外排泵AcrAB-TolC 基因的mRNA表达量的变化 根据GenBank 中大肠埃希菌相应基因序列设计外排泵基因acrA、acrB、tolC、acrZ荧光定量PCR 扩增引物,以大肠埃希菌的看家基因gapA为内参,见表2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。提取细菌总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA 为模板上机检测。反应条件:95 ℃30 s,95 ℃5 s,61 ℃35 s,共40 个循环,每次循环读板1 次;熔解曲线测定:65～95 ℃,每0.5 ℃读板1 次,持续5 s。

1.5.1 细菌处理 将细菌培养8 -12 h 后,接种于LB 肉汤中,培养至生长对数期(OD600=0.7～0.8)。以标准菌株为对照组,安妥沙星诱导后的耐药菌株为试验组。

1.5.2 总RNA 的抽提 按试剂盒说明书操作步骤抽提总RNA。

1.5.3 反转录 按GoScriptTMReverse Transcription System 反转录试剂盒说明书操作步骤合成cDNA。

表2 目的基因用于荧光定量PCR 扩增引物

1.5.4 荧光定量PCR 检测 (1)荧光定量PCR反应:将cDNA 样品作为模板上机检测。反应条件:95 ℃30 s,95 ℃5 s,61 ℃35 s,共40 个循环,每次循环读板1 次;熔解曲线测定:65～95 ℃,每0.5 ℃读板1 次,持续5 s;(2)熔解曲线:每个样品做3 次平行重复;(3)样品扩增曲线:试验设计为组内3 次试验,观察试验重复性是否良好。

2 结果

2.1 安妥沙星及其他药物对诱导前后大肠埃希菌MIC 的测定 经安妥沙星诱导后的细菌对乳酸环丙沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素和磺胺嘧啶均呈现出高度耐药,对安妥沙星耐药的大肠埃希菌极易对其他氟喹诺酮类药物产生交叉耐药,同时对其他类的抗菌药物也产生了多重耐药(表3)。

表3 安妥沙星及其他药物对诱导前后菌株的MIC(μg/mL)

2.2 安妥沙星诱导前后acrA、acrB、tolC、acrZ突变情况

2.2.1 PCR 扩增结果 各基因电泳条带均在相应范围内,且条带单一,说明目的基因被有效扩增且无非特异性条带,可用于后续试验(图1)。

图1 tolc、acrA、acrB2、acrB1和acrZ 基因电泳图

2.2.2 目的基因测序结果 由表4 可见,与诱导前菌株相应基因序列对比,诱导后的耐药菌株除acrZ未发生碱基突变外,其余基因均发生碱基突变,其中:acrA8 处、acrB40 处、tolC27 处。但本试验中acrA碱基位突变,因密码子具有兼并性并没有使氨基酸发生突变;acrB编码的氨基酸序列只出现了1 个位点突变596Asn→His;tolC编码的氨基酸序列出现了3 个位点突变,分别是:13Leu→Phe、160Tyr→Asp、482Thr→Ser。

2.3 安妥沙星处理前后acrA、acrB、tolC、acrZmRNA 表达量的变化

2.3.1 扩增和熔解曲线的建立 实时定量PCR 扩增的基因,系统自动生成扩增曲线和熔解曲线,acrA、acrB、tolC、acrZ和gapA的扩增曲线和熔解曲线如图2 和图3 所示。熔解曲线峰单一无杂峰,表明PCR 扩增产物解链温度稳定,PCR 扩增产物单一,引物设计合理,且无非特异性产物,可以进行后续试验。

2.3.2 安妥沙星诱导前后acrA、acrB、acrZ、tolCmRNA表达量的变化 使用2-△△Ct法进行数据分析(图4),与诱导前菌株相应基因mRNA 表达量相比,诱导后菌株acrA、acrB、acrZ、tolC的mRNA 表达量均极显著增加。mRNA 的表达量增加在一定程度上会使得细胞膜上的外排泵蛋白AcrAB-TolC 数量增加,从而更快地将菌体内抗菌药物泵出菌体外,使得大肠埃希菌对多种药物的耐药性增加。

表4 试验菌株目的基因碱基和氨基酸序列突变情况

图2 扩增曲线

图3 熔解曲线

3 讨论

图4 安妥沙星处理前后菌株acrA、acrB、acrZ、tolC mRNA 表达量变化

3.1 安妥沙星诱导耐药菌株对多种抗微生物药物耐药 大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要包括:(1) 药物作用靶位基因突变; (2) 细菌细胞膜通透性改变; (3) 主动外排。表3 中安妥沙星及其他药物对诱导前后大肠埃希菌MIC 结果显示,经安妥沙星诱导的菌株可同时对乳酸环丙沙星、恩诺沙星等氟喹诺酮类药物交叉耐药,同时会对盐酸土霉素、硫酸庆大霉素和磺胺嘧啶产生多重耐药,这表明此次安妥沙星诱导所得的耐药菌株其耐药性不具有很强的特异性,对多种抗微生物药物的耐药机制有着共同之处。药物主动外排是大肠埃希菌多重耐药的主要机制,外排泵AcrAB-TolC是大肠埃希菌最为重要的外排泵,也是目前研究比较清楚的细菌外排泵,能够同时外排多种抗菌药物、有机溶剂、染料及去污剂等使细菌产生高水平多重耐药[5]。体外诱导耐药过程中可能也会同时引起其他抗菌药物的耐药基因决定簇/耐药基因位点发生了变化,Oethinger[6]等研究表明,在敲除acrAB的情况下,仅依靠促旋酶突变不能使野生型大肠埃希菌达到临床相关水平的氟喹诺类药物抗性。因此外排泵AcrAB-TolC在大肠埃希菌的固有和获得的氟喹诺类药物抗性中起到关键作用。

3.2 体外诱导的耐药菌株外排泵基因突变及表达量变化 由表4 可以看出,与原菌株相比,诱导耐药菌株的acrA、acrB和tolC基因的碱基序列变化最多,点突变的数量分别是8、40 和27,且acrB和tolC基因中都有氨基酸突变。Chen[7]等用氟喹诺酮类药物对大肠埃希菌进行体外诱导时,发现诱导后的耐药菌株其acrA/B和tolC的碱基及氨基酸均发生了变化,说明细菌的耐药性与外排泵基因的突变有一定的相关性。acrZ基因属于高度保守的基因,此次也未发现其发生突变。

外排泵AcrAB-TolC 属于RND 家族[8-9],由AcrA、AcrB、TolC 蛋白组成,以三聚体复合模式存在于细菌的细胞膜上,AcrB 为外排转运蛋白,TolC 为外膜通道蛋白,AcrA 为周质连接蛋白,位于周浆间隙中,两端连接TolC 和AcrB,形成一个贯通内外膜的孔道,是药物外排的主要途径。在AcrB 与底物结合的部位还有一个特殊小蛋白AcrZ[10-11],可通过对AcrB 的变构调节来影响AcrB 对底物的选择性,从而影响细菌对药物的敏感性。图4 中acrA、acrB、acrZ、tolC的mRNA 表达量均极显著增加,理论上就会产生更多相应的外排泵蛋白。Mazzariol[12]等发现10 株临床分离的大肠埃希菌中有9 株的AcrA 过表达≥170%,具有高水平的环丙沙星耐药性(MICs,≥32 μg/mL)。Baucheron[13]等的研究表明,AcrB 多药转运蛋白在鼠伤寒噬菌体DT204 型肠道沙门菌的高水平氟喹诺酮耐药中发挥重要作用。Sulavik[14]等的研究表明,敲除acrAB或tolC基因会导致大肠埃希菌的敏感性增加,进一步证实了AcrAB-TolC 外排系统在高水平氟喹诺酮类药物耐药中的重要性。Hobbs[15]等研究发现,acrZ基因缺失突变体的耐药性显著下降,AcrZ 特异性结合AcrB 可增强细菌耐药性。四种蛋白均过量表达,协调配合形成更多结构和功能完整的外排泵AcrAB-TolC,从而更快地将菌体内抗菌药物泵出菌体外,使得大肠埃希菌对多种药物的耐药性增加,多药耐药程度随表达量增加而增强。

安妥沙星体外诱导大肠埃希菌标准菌株,可产生具有多重耐药表型的耐药株,且耐药株对安妥沙星和其他抗微生物药物的多重耐药机制有一定的共同之处,与外排泵蛋白AcrAB-TolC 的过量表达有一定的相关性。