内皮素-1基因多态性与脑出血的关系及其对血压的影响☆

易袁晶 魏雪利 马明明

刘宝琼△ 胡治平** 肖波△ 曾艺*○☆

研究发现长沙地区脑出血年平均发病率为131.0/10万，脑出血占脑卒中的比例为55.4%，远高于世界平均水平，其中79.8%脑出血患者患有高血压病[1]。在长沙汉族人群研究中，证实遗传因素与脑出血发病有关[2-4]。近期研究表明，脑出血急性期人体ET-1血浆水平升高，且与颅内血肿大小成正相关[5]，提示ET-1可能参与脑出血的发病。ET-1基因单核苷酸多态（single nucleotide polymorphisms,SNPs）已被证实参与了包括高血压、动脉粥样硬化在内的多种人体疾病发生、发展的病理过程[6]。本研究拟利用长沙汉族人群研究ET-1基因两个常见 SNPs（rs5370、rs1800541）与脑出血的关系，并探讨对其血压的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2006年1月至2009年12月于湘雅医院就诊的脑出血患者作为研究对象，收集其临床资料和外周血标本。纳入标准：①年龄≥18岁；②湖南省长沙地区汉族人；③头颅CT平扫和/或头颅MRI平扫证实为急性脑出血，且符合第四届全国脑血管病学术会议诊断标准[7]；④发病至住院时间≥14 d。排除标准：①外伤、药物、动脉炎、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤引起的脑出血病例；②混合型脑血管病（梗死后出血或出血后梗死）的病例；③肝肾功能障碍、血液病及溶栓治疗接受者、甲状腺疾病、自身免疫型疾病及妊娠者。

随机选取同期在中南大学湘雅医院的健康体检人员作为对照组，收集其临床资料和外周血标本。纳入标准：①年龄≥18岁；②湖南省长沙地区汉族人。排除标准：①脑血管病、血液病、肝肾疾病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病、及妊娠者；②无脑血管病家族史。

脑出血组、对照组成员均无血缘关系，并签署知情同意书。研究方案通过医学伦理委员会批准。

1.2 血清标本的采集研究对象禁食12 h，次日清晨7时至 8时采外周静脉血 10 mL，取 5 mL（不抗凝）静置 1 h，2000 r/min常温离心后分离血清，将血清置于4℃冰箱保存，用于血脂测定，其余5 mL（肝素抗凝）用于DNA制备。

1.3 收缩压、舒张压和平均动脉压的测定测量脑出血患者入院时、发病1周后和发病2周后血压，3次血压均超过140 mmHg/90 mmHg、发病之前确诊过高血压病或者口服高血压药物者诊断为临床高血压病。将脑水肿高峰期前或者高峰期过后的血压水平进行记录。

1.4 基因分型利用常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。用于扩增ET-1基因两个SNPs位点的PCR引物序列经Primer 3.0设计，由上海生工公司合成。引物序列：rs5370F AAGAGTTGCGGCGGGTGGT，rs5370R AATGTGCTCGGTTGTGGGTCA；rs1800541F GGCATCCCCTGGGAAGAGA CT，rs1800541R TGCATGGAACACATTGGCTTTT。 PCR 反应条件：96 ℃预变性 15 min；96 ℃ 10 s，50℃ 5 s，60 ℃ 30 s，28个循环；60℃延伸1 min。根据美国ABI公司的操作说明采用SAP/ExoⅠ酶法对PCR产物进行纯化。根据SNP上游序列，使用Primer 3.0设计ET-1基因两个SNPs位点的单碱基延伸引物。延伸引物序列：rs5370SF TTTTATCCCAAGCTGAAAGGCAA，rs1800541SR TTTTTTTTTTTTTGA ATTTTTGTTTGTTCTCCACCA。延伸反应条件：96℃预变性1 min；96℃变性 10 s，50℃退火 5 s，60 ℃延伸 30 s，28个循环；60℃延伸1 min。延伸产物纯化：在10 μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴 1 h，然后75℃灭活15 min。纯化后的延伸产物在ABI 3130XL测序仪上样。收集ABI 3130XL测序仪上的原始数据，用GeneMapper 4.0进行SNP信息分析。选取有代表性的样本对每种基因型测序，在SNP数据库中对测序结果进行比较分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 16.0进行统计，按Hardy-Weinberg平衡法检验群体代表性。对脑出血与正常对照组两组间基因型和等位基因的频率比较采用χ2检验，血压水平和不同基因型亚组间血压比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况共纳入脑出血患者195例，男133例，女62

例，平均(55.40±11.21)岁；对照组 116例，男 41例，女 75例，平均(54.97±10.41)岁。两组在年龄、性别、体重指数、吸烟史方面差异无统计学意义。脑出血组冠心病史、高血压病史和糖尿病史均高于对照组（P＜0.05）。血压水平比较，脑出血组的平均动脉压显著高于对照组（P＜0.05）。血脂水平比较，脑出血组甘油三脂和高密度脂蛋白胆固醇水平（HDL-C）显著低于对照组（P＜0.05）。

2.2ET-1基因rs5370、rs1800541多态分布116例健康对照中，成功分型出114例，阳性检出率＞95%。各SNPs的基因型及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。研究发现长沙地区汉族人群中，ET-1基因rs5370多态有GG、GT、TT三种基因型，ET-1基因rs1800541多态有 TT、TG、GG三种基因型。选取具代表性样本进行直接测序，各位点基因型全部与测序结果吻合见（图1）。通过查询http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/中 dbSNP， 我们ET-1基因rs5370、rs1800541多态的基因型及等位基因频率及与其他人群比较结果见表 1、2，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3ET-1基因rs5370、rs1800541多态与脑出血的关系本研究195例脑出血患者中，成功分型出194例，阳性检出率＞95%。脑出血组与对照组的ET-1基因rs5370、rs1800541多态基因型及等位基因频率比较见表3。脑出血组与对照组ET-1基因rs5370、rs1800541基因型及等位基因频率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。ET-1基因rs5370、rs1800541多态性与脑出血的易感性之间无明显相关性。

2.4ET-1基因rs5370、rs1800541多态对血压的影响脑出血组与对照组ET-1基因rs5370、rs1800541多态不同基因型对收缩压 (systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)和平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)的影响见表4。脑出血组及对照组ET-1基因rs5370、rs1800541多态各基因型亚组间 SBP、DBP和 MAP水平均无统计学差异(P＞0.05)。

3 讨论

内皮素-1（endothelin-1,ET-1）是内皮素家族的主要成员，也是人体内内皮素的主要存在形式，主要由血管内皮细胞分泌[8]，能通过长程收缩血管导致血压升高，现已被认为是高血压的一个重要危险因素[6]。高血压是脑出血的主要病因。赵永波等[9]发现ET-1可能为高血压及高血压性脑出血的共同危险因素，并参与、影响高血压性脑出血的病理生理过程。武婕等[10]研究表明血浆ET水平的升高程度与脑出血量有一定关系。ET-1的血浆水平及其生物学活性均主要由ET-1基因调控[6]。

表1正常对照人群中rs5370多态分布及其他人群比较

图1 ET-1基因rs5370、rs1800541多态基因分型结果与测序图。A～C为 ET-1基因rs5370多态位点的基因分型结果，分别代表GG、TT、GT基因型；D～F为 ET-1基因 rs1800541多态位点的基因分型结果，分别代表 TT、GG、TG基因型；G～I为 ET-1基因rs5370多态位点正向测序图，分别代表GG、GT、TT基因型；J～L为 ET-1基因rs1800541多态位点反向测序图，分别代表TT、TG、GG基因型

表2正常对照人群中rs1800541多态分布及其他人群比较

表4 脑出血组与对照组ET-1基因rs5370、rs1800541多态对血压的影响

ET-1基因rs5370多态一直是ET-1基因与疾病研究的主要目标多态位点[11]。既往研究表明，ET-1基因rs5370等多态与普通人群高血压病无关，仅与某些特殊人群（如肥胖患者、孕妇等）中的高血压相相关[12-14]。有关rs5370与脑出血的相关性尚未见报导。PANOULAS等[15]发现ET-1基因rs1800541与rs5370多态构成的单倍体（T-T）与风湿性关节炎患者ET-1血浆水平增高及其罹患高血压 （舒张压升高为主）的风险增高有关。因此，我们的研究特意选择了ET-1基因rs5370多态及与rs5370多态在同一染色体上并位置邻近的ET-1基因rs1800541多态作为候选位点。研究结果显示长沙地区汉族人群中，脑出血ET-1基因rs5370、rs1800541多态基因型及等位基因频率分布与对照组比较均无显著性差异，提示ET-1基因rs5370、rs1800541多态可能与脑出血的发病无关。我们加做了其单体型与脑出血的关系研究，但仍未得到阳性发现。

本研究显示对照组ET-1基因rs5370、rs1800541多态基因型亚组间的血压水平无统计学差异（P＞0.05），与既往研究结果相符。本研究显示脑出血组的平均动脉压显著高于对照组 （P＜0.05），但脑出血组ET-1基因rs5370、rs1800541多态基因型亚组间的血压水平无显著性差异（P＞0.05）， 提示ET-1基因 rs5370、rs1800541 多态可能不是影响脑出血患者血压水平的重要因素。

综上所述，在长沙汉族人群中，采用病例-对照法对ET-1基因rs5370、rs1800541多态与脑出血的关系进行研究，结果提示ET-1基因rs5370、rs1800541单核苷酸多态可能与脑出血的发病无关，并可能不是影响其血压水平的重要因素。但脑出血是一种多基因复杂性状疾病，其遗传模式复杂、未知，加上遗传异质性、表型异质性及各种环境因素的影响，仍须在不同种族、地域人群中进行更大样本量的研究，以进一步明确ET-1基因rs5370、rs1800541多态与脑出血的关系。