Bacillus malacitensis Z-5 菌株合成抑菌物质培养基优化及成分鉴定

2019-06-14高宇陈尧尧刘忆杰陈晓萌高同国张冬冬

棉花学报 2019年3期

高宇，陈尧尧，刘忆杰，陈晓萌，高同国，张冬冬

（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001）

棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的维管束系统病害，对棉花生产造成巨大损失[1-2]。其主要防治方法有培育抗性品种、农业防治和化学防治等，但选育高抗棉花黄萎病的优质品种目前存在一定困难，农业措施中常用的轮作难以应用于大面积的棉花生产中，化学防治污染环境并且在杀死病原菌的同时杀死大量的有益微生物[3-5]。生物防治由于对人畜安全无毒、无污染、无残留，具有不易使病原菌产生耐药性，生产工艺较简单，且有些生防微生物能促进作物生长，因而受到研究者的青睐[6-7]。

芽孢杆菌（Bacillusspp.）可在植株根、茎、叶等部位有效定植[8]，产生多种次生代谢产物，对植物真菌、细菌、线虫病害均表现显著拮抗作用。产生抗逆耐热的芽孢是芽孢杆菌的突出特征，这有利于生防菌的筛选、发酵生产、剂型加工及储存运输[9]。

芽孢杆菌能够产生多种抑菌物质，目前研究较多的有脂肽抗生素[10-11]、抗菌蛋白[12-13]、挥发性有机物[14]及聚酮类化合物[15]等。脂肽抗生素是芽孢杆菌产生的1 类非常重要的抑菌物质，对热不敏感，能够耐受酸性环境及蛋白酶处理，性质稳定，为利用其防治植物真菌病害奠定了基础[16]。按照结构的不同，脂肽抗生素主要分为表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和芬革素（fengycin）[11]。表面活性素具有一定程度的抗细菌活性，同时能有效降低植物根部表面张力，有利于生防菌的游动性和生物膜的形成[17]。伊枯草菌素具有强烈的抗真菌活性，包含iturin A、B、C、D、E，杆菌霉素（bacillomycin）D、F、L、LC 和抗霉枯草菌素（mycosubtilin）[18]。芬革素具有广谱抗真菌活性，特别是对丝状真菌[19-20]。

张冬冬等从棉田中分离出1 株对大丽轮枝菌有显著拮抗活性的Bacillus malacitensisZ-5 菌株[21]，采用抗利福平和抗病原真菌法对该菌株进行标记，检测表明Z-5 菌株能够在棉花根际土壤及植株体内有效定植，这为拮抗菌在土壤中发挥有效的生防效果奠定了基础[22]。本研究以Z-5 菌株为材料，通过响应面法优化其产生抑菌物质的培养基组成，并对抑菌物质成分及其合成相关基因进行检测，为利用该菌株进行棉花黄萎病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和Bacillus malacitensisZ-5 菌株由河北农业大学制药工程实验室保存。

基础发酵培养基：葡萄糖2.0%（质量分数，下同）、蛋白胨2.0% 、Na2HPO4·12H2O 0.8% 、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%，pH 7.2～7.4。

1.2 培养基成分单因素优化

选取9 种碳源为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、玉米粉、果糖、麦芽糖、麸皮、糊精，6 种氮源为牛肉膏、硫酸铵、黄豆饼粉、胰蛋白胨、尿素、酵母粉，6种无机盐为K2SO4、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O，在基础发酵培养基中，单因素变化碳源、氮源、无机盐种类（添加量保持原配比），配制相对应的发酵培养基。将保存的Z-5 菌株接种于营养琼脂（Nutrient agar，NA）斜面培养基上，37 ℃恒温培养过夜，挑取菌苔接种到营养肉汤（Nutrient broth，NB）培养基中37 ℃恒温振荡培养过夜，培养液以10%（体积分数）的接种量接入配制的培养基中（250 mL的三角瓶装液量为50 mL），37 ℃恒温振荡培养48 h。将发酵液于 10 000 r·min－1离心 10 min，回收上清液，用亲水微孔过滤器（孔径0.22 μm，天津津腾实验设备有限公司生产）过滤，滤液进行抑菌物质活性检测。

1.3 抑菌物质活性检测

将保存的大丽轮枝菌接入马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）斜面培养基中，25 ℃恒温培养5～7 d，用无菌水将大丽轮枝菌孢子悬浮并调整其含量为1×106mL－1，将PDA 培养基融化并冷却至约45 ℃，吸取10 mL 病原菌孢子悬浮液和100 mL PDA 培养基（硫酸链霉素质量浓度为 40 mg·L－1）混合后制作 PDA 培养基平板。凝固后，在距离PDA 培养基平板中心2.2 cm的位置均匀打4个直径为0.7 cm 的孔，在每个孔中加入30 μL 按1.2 方法制备的发酵上清液，以相应的培养基作为阴性对照。每个样品3个重复。于25 ℃恒温培养5 d 后，测量抑菌圈直径[20]。以抑菌圈直径为指标，选择最优碳源、氮源、无机盐，从而达到培养基的优化。

1.4 响应面分析试验及培养基的优化方法

根据1.2 的筛选结果，确定最佳碳源、氮源、无机盐，运用最速上升法（Steepest ascent design，SAD），确定各因素的最优变化区域[23]，利用Box-Behnken 方法设计三因素（玉米粉、酵母粉、K2SO4）三水平（玉米粉含量：2%、3%、4%；酵母粉含量：1% 、2%、3%；K2SO4含量：0.02% 、0.03% 、0.04%）试验，以抑菌圈直径为检测指标，运用Design Expert 软件拟合上述试验数据得到响应面二阶模型，绘制响应面分析图，分析确定最优培养基配方，利用最优培养基配方通过抑菌物质活性检测进行验证。

1.5 Z-5菌株合成抑菌物质鉴定

将Z-5 菌株接种到NB 培养基中，37 ℃振荡培养过夜，将培养液以10%（体积分数）接种量接种到优化后的培养基中，37℃振荡培养48 h，8 000 r·min－1离心 10 min 并回收上清液，将上清液用 6 mol·L－1的盐酸溶液调整 pH 到 2，放置于4 ℃冰箱中过夜，8 000 r·min－1离心 10 min 并回收沉淀。将沉淀用pH 2 的去离子水冲洗2 遍，并用甲醇萃取2 遍，将2 次的萃取液合并后用疏水微孔过滤器（孔径0.22 μm，天津津腾实验设备有限公司生产）过滤，用液质联用技术（Liquid Chro matography-Mass Spectroscopy，LC-MS）进行分析[24-25]。采用安捷伦1200 系列高效液相色谱仪（Santa Clara，USA）和安捷伦 MS-C18 反相柱（长50 mm，内径2.1 mm，介质粒径1.8 μm）对抑菌物质进行分离。流动相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液和乙腈以60∶40 比例混合，流速为0.8 mL·min－1，柱温为 25 ℃，检测波长为 210 nm。高效液相分离的化合物相对分子质量利用安捷伦6410三重四极杆质谱仪进行测定，电离方式采用电喷雾离子源，质量检测器为四级质量分析器，喷雾电压为4.5 kV，毛细管温度为300 ℃，检测方式为正离子模式[26]。

1.6 Z-5菌株合成抑菌物质相关基因检测

利用细菌基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取Z-5 菌株基因组DNA 为模板。扩增ituC基因采用引物ITUCF1：TTCACTTTTGATCTGGCGAT和ITUCR3：CGTCCGGTACATTTTCAC；扩增ituD基因采用引物ituD2F：GATGCGATCTCCTTGGATGT和ituD2R：ATCGTCATGTGCTGCTTGAG；扩增srfAB基因采用引物 110F：GTTCTCGCAGTCCAGCAGAAG 和110R：GCCGAGCGTATCCGTACCGAG[27-28]。根据设计引物的退火温度和扩增片段大小设计聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）程序。反应体系：10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol·L－1dNTP 4 μL、10 μmol·L－1上下游引物各 2 μL、5 U·μL－1DNA 聚合酶 0.25 μL、DNA 1 μL，加 ddH2O 至 50 μL。PCR 反应结束后，用 1%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物由北京华大基因有限公司进行测序。基因序列在美国国立生物技术信息中心（National center for biotechnology information，USA，NCBI）网站利用BLAST进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 碳源对Z-5菌株产生抑菌物质的影响

如图1 所示，9 种碳源中，以甘露醇作为碳源时抑菌圈直径最大，达到1.2 cm，玉米粉、麦芽糖次之，三者之间差异不显著。考虑生产成本因素，将玉米粉选作最佳碳源。

2.2 氮源对Z-5菌株产生抑菌物质的影响

如图2 所示，6 种氮源中，酵母粉的抑菌圈直径为1.4 cm，大于其他氮源，抑菌效果最明显。因此，选择酵母粉作为最佳氮源。

图1 9 种碳源对Bacillus malacitensis Z-5 菌株产生抑菌物质的影响Fig.1 Effects of nine carbon sources on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

图2 6 种氮源对Bacillus malacitensis Z-5 菌株产生抑菌物质的影响Fig.2 Effect of six nitrogen sources on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

2.3 无机盐对Z-5菌株产生抑菌物质的影响

以K2SO4作为无机盐时，抑菌圈直径为1.2 cm（图3），抑菌效果较好。所以，选择 K2SO4作为发酵培养基配方的无机盐。

2.4 响应面试验结果分析

Box-Behnken 试验得到的数据见表1。对优化试验数据进行二次多项式回归拟合，获得抑菌圈直径与培养基中玉米粉、酵母粉、K2SO4含量的二次多项式回归方程为r1＝－0.726 62 ＋0.512 25A＋0.597 63B＋59.487 5C－（5.000E－0.03）AB ＋2.000AC －7.425BC －0.106 63A2－0.117 38B2－823.750C2。其中，抑菌圈直径预测值为r1，A、B、C 分别表示培养基中玉米粉、酵母粉、K2SO4的含量。该二次多项式模型及其各项系数的方差分析结果显示，模型回归P值为0.000 1、失拟项P值为 0.090 5，决定系数R2值为 0.971 8，说明该回归方程显著可靠且拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性。因此，构建的该二次多项式模型可以用于Z-5 菌株抑菌圈直径的理论预测。

图3 6 种无机盐对Bacillus malacitensis Z-5 菌株产生抑菌物质的影响Fig.3 Effects of six kinds of inorganic salts on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

表1 Box-Behnken 响应面优化试验结果Table 1 Box-Behnken values by the response surface design

另外，根据绘制的响应面分析图（图4），分析3个变量因素中两两变量中的交互影响作用，进一步确定该试验设计的优化结果。当K2SO4的含量固定，玉米粉处于相对较低水平时，抑菌圈直径较大，Z-5 菌株的抑菌效果较好（图4A）；当酵母粉处于较低水平时，抑菌圈直径较大（图4B）；K2SO4对抑菌效果影响不大（图4C）。综合以上结果，玉米粉、酵母粉含量均较低时抑菌圈直径较大，K2SO4的含量对抑菌效果影响不大。

通过Design Expert 软件最终得到优化后的培养基配方为玉米粉2.68%、酵母粉1.45%、K2SO40.03%、Na2HPO4·12H2O 0.8%、NaH2PO4·2H2O 0.2%（pH 7.2～7.4）。根据二次多项式回归方程预测抑菌圈直径为1.36 cm，优化后的培养基发酵上清液抑菌活性检测得到的抑菌圈直径为1.34 cm，与预测值接近，说明该模型有效、可靠。

图4 营养成分含量对抑菌圈直径交互影响的三维曲面Fig.4 Three-dimension curved surface diagram of interaction effect of nutrition content on the diameter of antifungal zone

2.5 Z-5菌株抑菌物质鉴定

采用LC-MS 鉴定了B.malacitensisZ-5 发酵上清液中抑菌物质成分（图5）。保留时间为0.264 min 的组分中，未检测到抑菌物质存在（图6A）；质荷比为1 046.57 的物质峰对应的离子类型为[M＋K]＋，与C14 surfactin B 离子加成峰一致；1 107.66 对应[M＋Na]＋，为 C17 iturin A（图6B）。1 043.78 峰对应[M＋H]＋，为 C14 iturin A（图6C）。1 057.84 峰对应[M＋H]＋，为 C15 iturin A（图6D）。1 058.37 峰对应[M＋H]＋，为 C15 iturin B；1 066.65 峰对应[M＋Na]＋，为 C14 iturin B；1 123.29 峰对应[M＋K]＋，为 C17 iturin A（图6E）。1 071.93 峰对应[M＋H]＋，为 C16 iturin A（图6F）。1 085.86 峰对应[M＋H]＋，为 C17 iturin A；1 108.68 峰对应[M＋Na]＋，为 C17 iturin B（图6G）。1 095.19 峰对应[M＋K]＋，为 C15 iturin A；1 123.59 峰对应 [M＋K]＋，为 C17 iturin A （图6H）。综上所述，Z-5 菌株合成 C14 surfactin B，C14～C17 iturin A，C14、C15、C17 iturin B 等脂肽抗生素（图6）。

图5 Bacillus malacitensis Z-5 菌株发酵液粗提取物液质联用阳离子流谱图Fig.5 The positive ion flow spectra of LC-MS for the crude extract from Bacillus malacitensis Z-5 fermentation supernatant

图6 Bacillus malacitensis Z-5 合成抑菌物质质谱图Fig.6 Mass spectrum of antifungal substances from Bacillus malacitensis Z-5

2.6 Z-5菌株抑菌物质合成相关基因检测

Z-5 菌株基因组脂肽抗生素合成相关基因srfAB、ituC和ituD的检测结果如图 7 所示。在NCBI 上的 BLAST 同源性分析表明，srfAB与解淀粉芽孢杆菌UCMB5036 菌株编码表面活性素合成酶亚基2 的srfAB同源性为99%，ituC与解淀粉芽孢杆菌UCMB5036 菌株编码伊枯草菌素合成酶 C 的ituC同源性为99%，ituD与解淀粉芽孢杆菌YNM3 菌株编码丙二酸单酰辅酶A 酰基转移酶的ituD同源性为99%。其中基因ituC和ituD与伊枯草菌素合成相关，基因srfAB与表面活性素合成相关。

图7 Bacillus malacitensis Z-5 菌株合成抑菌物质相关基因的PCR 扩增检测结果Fig.7 Testing results of PCR detection of antifungal substances related genes of Bacillus malacitensis Z-5 strain

3 讨论

生防芽孢杆菌在国外应用广泛，由Gustafson公司研发的枯草芽孢杆菌GB03 对棉花、大豆等土传真菌病害防治效果显著，至今在美国市场销售良好[29]。芽孢杆菌在国内的应用前景也被看好，乔俊卿等利用枯草芽孢杆菌Bs916 防治番茄青枯病[30]，林东等发现枯草芽孢杆菌SO113 对水稻白叶枯病菌具有强烈的抑制作用[31]。

在实际研究中，响应面分析法可节省研发时间，提高产品质量，是应用较多的方法。培养基成分对抑菌物质的产生影响较大，通过单因素试验确定最优的碳源、氮源和无机盐分别为玉米粉、酵母粉和K2SO4。本研究同时考虑碳源、氮源、无机盐3个因素，利用最速上升法确定最优变量区域，其中玉米粉为2%～4%（质量分数，下同），酵母粉为1%～3%，K2SO4为0.02%～0.04%。结合Box-Behnken 设计试验分析出最佳水平配比，在整个区域范围内分析得出精确度较高的响应值为抑菌圈直径的回归方程[32]，其中玉米粉和酵母粉处于设定区间的较低水平时，能够获得最优的抑菌活性，减少了试验次数和试验周期。同时，B.malacitensisZ-5 在得到的最优培养基中发酵，其合成的抑菌物质对大丽轮枝菌拮抗效果显著。

产生抑菌物质是生防菌发挥效用的基础，但抑菌物质的产生受多种因素影响，这往往导致生防菌在实验室条件下的拮抗效果和田间防治效果之间存在较大差异。直接利用芽孢杆菌产生的抑菌物质进行植物病原菌的防治，所受限制因素较少，并且安全环保，是1 种环境友好型微生物农药资源[33]。

通过LC-MS 技术和PCR 检测，初步确定Z-5 菌株合成并分泌伊枯草菌素A、伊枯草菌素B 和表面活性素B 等脂肽抗生素。伊枯草菌素具有强烈的广谱抗真菌活性，对细菌的拮抗作用较小，无抗病毒活性。表面活性素虽然没有显著的抗真菌活性，但与其他脂肽抗生素如iturin A 等共同作用时能够显著增强其抑菌活性[34]，枯草芽孢杆菌YB-05 对小麦全蚀病的防治效果优于化学试剂，其产生的抑菌物质主要为iturin A 和surfactin[35]。番茄内生枯草芽孢杆菌B47 能显著抑制玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolaris maydis）的生长，其抗菌活性物质为iturin A2，体外试验、盆栽试验和田间试验表明，部分提纯的iturin A2 能显著抑制玉米叶枯病的发生[36]。由此预见，利用Z-5 菌株合成的抑菌物质进行棉花黄萎病等植物病害的防治有广阔的应用前景。

本研究仅从培养基成分角度出发对Z-5 菌株产生抑菌物质的条件进行了优化，然而芽孢杆菌的最优生长条件和抑菌物质生成能力的影响因素还包括pH、培养温度、装液量以及接菌量等，这些因素对抑菌物质产生的影响还有待进一步检测。