嗜酸乳杆菌对宫颈上皮细胞SiHa细胞的黏附性研究

苗丽珍，刁韵婵，胡婷婷，杨船文，傅思武，张雅青

(西北民族大学 医学院，甘肃 兰州 730030)

乳酸杆菌作为妇女生殖道的优势菌群，对调节宿主生殖道菌群失调有十分重要的作用.乳酸杆菌通过黏附素与宿主生殖道上皮细胞受体结合空间占位定植，排斥外来的病原菌的黏附和入侵，保证宿主健康.检测黏附性强弱是其能否发挥微生态效应的重要因素和筛选过程中的首要指标，因为较强的生殖道黏附能力能让乳酸杆菌在生殖道发挥后续效益的时间延长.本实验以此为切入点，探讨嗜酸乳杆菌对SiHa细胞的黏附性，对进一步深入研发、应用生殖道微生态制剂提供实验室数据.

1 材料与方法

1.1 嗜酸乳杆菌和细胞

嗜酸乳杆菌(菌种编号：BNCC 336974)由西北民族大学医学院中心实验室保存并提供，SiHa细胞，购自上海中科院.

1.2 培养基和试剂

MRS肉汤培养基(乳酸杆菌选择性增菌培养基)购买于青岛海博生物技术有限公司；MEM细胞培养液、0.25%胰酶购买于Hyclone公司；无支原体新生牛血清购买于浙江天杭生物科技有限公司.MEM完全培养液由90%MEM培养液、10%新生牛血清(已灭活)、双抗组成.PBS缓冲溶液：取0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl和2.16 g NaHPO4·7H2O溶于1 000 mL双蒸水中，121 ℃，20 min灭菌，于4 ℃下保存，备用.

1.3 嗜酸乳杆菌培养

实验时将菌种接种于MRS肉汤培养基，37 ℃培养12～14 h，并转接2代.

1.4 SiHa细胞培养

实验时，将细胞置与25 cm2培养瓶中加入MEM完全培养液后，于37 ℃，含5%CO2的恒温培养箱中培养.待细胞贴壁生长良好时，用0.25%胰酶消化传代.通常隔2天更换培养液，4天进行消化传代，传代4次左右用于黏附试验.

1.5 嗜酸乳杆菌悬液的制备

将活化好的嗜酸乳杆菌接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃培养12～14 h，高速冷冻离心(1 000 r/min、20 min、4 ℃)收集菌体，用MEM完全培养液将菌悬液的A595调整至所需浓度.

1.6 嗜酸乳杆菌对SiHa细胞的黏附实验

将培养好的SiHa细胞进行消化，制成细胞悬液(105/mL )后，分别接种于放有盖玻片的6孔细胞培养板中,每孔2 mL，接种密度为(1-2)×105/mL,置于37 ℃,5% CO2培养箱中孵育，细胞贴壁.待细胞单个贴壁生长良好后，用无菌的PBS缓冲液漂洗3次，冲洗未贴壁和死去的细胞.每孔中加入菌悬液1 mL，与37 ℃,5%、CO2环境中共生培养，分别于1 h、2 h终止培养.依次取出6孔板，弃去悬液，用无菌PBS缓冲液洗涤6次,每次1分钟，以去除未黏附的嗜酸乳杆菌，分别经甲醛固定30 min.革兰染色后在油镜下随机选择30个细胞，计算其可视性细胞表面黏附的细菌数目，黏附实验重复3次.

1.7 统计学分析

实验结果采用平均值±标准差(mean±STDEV)表示.对黏附数值进行数据分析,采用双样本等方差假设的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结 果

显微镜下观察嗜酸乳杆菌对SiHa细胞黏附效果，结果见图1.统计学分析显示黏附1 h与2 h的嗜酸乳杆菌在相同菌浓度下差异都存在统计学意义(P<0.05)(见表1).

a.嗜酸乳杆菌与SiHa细胞黏附1 h;b.嗜酸乳杆菌与SiHa细胞黏附2 h

3 讨 论

3.1 嗜酸乳杆菌对SiHa细胞的黏附

嗜酸乳杆菌作为生殖道黏膜微生物屏障的一部分，不但能黏附于生殖道上皮细胞，还具有维持生殖道pH稳定，产生细菌素，阻止其他微生物定植生长，拮抗致病菌和有害微生物生长等作用[1].本实验通过嗜酸乳杆菌对SiHa细胞的黏附结果可以发现，嗜酸乳杆菌黏附SiHa细胞有一定的时间效应关系，在嗜酸乳杆菌和SiHa细胞共生培养1～2小时，其黏附指数有所增长.这可能与嗜酸乳杆菌有较高的表面疏水能力和自动聚集能力有关[2]，且与黏附存在一定的正相关性.另外，尹琼芳[3]用4M氯化钾处理嗜酸乳杆菌，S-层蛋白[4]在被去除后，菌体的聚集率降低，表明S-层蛋白在黏附过程中起到明显作用.本实验结果表明，随着黏附时间延长，嗜酸乳杆菌黏附的数量也随之增加，其原因可能是黏附时间延长其表层蛋白及多糖发生了增生[5].

3.2 嗜酸乳杆菌的研究意义

大量研究表明，传统抗生素在治疗生殖道感染时，多导致生殖道的微生态失调，预后不良.而乳酸杆菌活菌制剂在治疗阴道炎效果显著[6-7]，没有抗生素固有的耐药性，以及引起菌群失调及毒性反应的副作用,生殖道乳酸杆菌的优势被恢复，菌群失调恢复，从根本上克服了反复感染和迁延不愈.此外，研究表明,提高乳酸杆菌含量及阴道清洁程度有利于减少HPV病毒感染程度,从而降低宫颈癌变几率[8].现如今,随着妇女健康意识的不断提高以及经济的迅速发展，微生态疗法已成为防治生殖道感染的关键所在[9]，新型的生殖道微生态制剂市场需要量有了很大的提升.研究嗜酸乳杆菌对SiHa细胞的黏附性机制，对于开发该类微生态制剂具有重要意义.