血浆miRNA-320C和miRNA-6088对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值

王 蕤 吴素萍 徐品颖

(1.首都医科大学附属北京安贞医院临床营养科， 北京 100029; 2.首都医科大学附属北京安贞医院检验科， 北京 100029)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常见的微血管合并症，是终末期肾病的主要病因之一其基本特征是皮肤干燥，湿疹样皮炎和剧烈瘙痒。DN起病隐匿，发展至终末期肾病的速度是其他肾病的14倍，因此早期诊断对改善生活质量，提高患者生存率具有重要意义。近年营养治疗成为糖尿病治疗必不可少的措施之一，更在DN治疗中发挥重要作用。《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》[1]强调饮食治疗、医学营养治疗有利于减缓DN进展， 保护肾功能。众所周知，DN的主要临床特征是持续性蛋白尿、进行性肾小球滤过率降低和血压升高[2]。其中蛋白尿是目前诊断DN最有用的生物标志物。然而，最近的研究[3]表明，蛋白尿可能不能准确预测DN，并且作为临床相关性指标判断慢性肾脏病替代终点有争议。因此，目前探寻能够准确表征DN患者疾病发生和进展的生物标志物成为营养学和内分泌学界的新焦点。

miRNA是一种高度保守的单链非编码RNA，通过影响靶基因的转录和翻译来调控细胞的生长、分化、增生和凋亡[4]。研究[5]显示，DN患者肾组织或血清中miRNA-377、miRNA-146、miRNA-1303、miRNA-192、miRNA-216等的表达发生改变。而最近的研究[6]则显示，糖尿病患者体内存在的持续高葡萄糖环境刺激体液中miRNA的表达发生变化，并且这些变化出现在蛋白尿之前。笔者认为miRNA的表达可能是糖尿病肾病诊断和预后的潜在的生物标志物。最近，miRNA-320(miR-320)被发现与糖尿病肾病和系统性微血管损伤相关，但却在胰腺-肾脏移植后恢复正常[7]。另外，据报道[8]尿液中miR-320C和miRNA-6088(miR-6088)在Ⅱ型糖尿病肾病患者中过表达。因此，本研究通过检测52例健康人，56例Ⅱ型糖尿病患者和105例Ⅱ型糖尿病肾病患者外周血miR-320C和miR-6088的表达，以探讨miR-320C和miR-6088对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年6月至2016年12月在首都医科大学附属北京安贞医院就诊的161名Ⅱ型糖尿病患者，根据Mogenson分期标准[1]，将161名Ⅱ型糖尿病(type Ⅱ diabetic nephropathy, T2D)患者分为T2D组[n=56,尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion rates，UAER) <20 μg/min]和DN组(n=105,UAER> 20 μg/min)，另选同时期体检的健康人52例作为正常对照组(normal control,NC)。研究排除年龄65岁以上，继发性糖尿病、恶性肿瘤、创伤、感染和自身免疫性疾病的患者，其他临床资料如表1所示。

1.2 诊断标准

Ⅱ型DN诊断标准依据《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》[1]，Ⅱ型糖尿病患者符合下列任何一项者：①大量白蛋白尿；②糖尿病视网膜病变伴任何一期慢性肾脏病即诊断为Ⅱ型DN。

1.3 临床指标

所有患者于清晨空腹状态下，抽取外周血5～10 mL，离心1 000 g，10 min(5810R，德国Eppendorf公司)收集血浆。全自动生化分析仪(AU680，美国Beckman Coulter公司)测量血清肌肝(serum creatinine,SCr)，总胆固醇(total cholesterol， TC)，三酰甘油(triglycerides， TG)，高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol， HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol， LDL-C)；血糖仪(ACCU-CHEK，瑞士Roche公司)测定餐后2 h血浆葡萄糖(2 h postprandial plasma glucose， 2 h PPG)和空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG)；糖化血红蛋白检测仪(挪威AXIS-SHIELD公司)，测定糖化血红蛋白(human glycated hemoglobin A1C, HbA1C)含量。

根据CKD-EPI公式[9]，估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。GFR=a×(SCr/b)c×0.933×年龄; 女性：a=144，b=0.7，c =-0.329(当SCr≤0.7 mg/dl时)或c =-0.120 9(当SCr> 0.7 mg/dl时); 男性：a=141，b=0.9，c =-0.411(当SCr≤0.7 mg/dl时)或c =-1.209(当SCr> 0.7 mg/dl时)。分离RNA合成cDNA。PCR参数设置：16 ℃ 30 min, 37 ℃， 60 min和85 ℃ 5 s。

RT-qPCR：用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(日本TakaRa公司) 制备20 μL RT-qPCR系统，并使用ABI 7500荧光定量PCR仪器 (美国Applied Biosystems公司)进行扩增。PCR参数设置：95 ℃ 30 s，90 ℃ 5 s， 65 ℃ 30 s， 40个循环。以U6为内参，用2△t法(△t=CTmiRNA-CTU6)计算miR-320C和miR-6088的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件分析数据，对所有计量资料进行正态性检验。组间比较时资料满足正态分布，采用方差分析，组间两两比较时采用LSD法；资料不满足正态分布，采用秩和检验；分类资料采用χ2检验。资料正态分布的前提下采用Pearson相关分析，用于miRNA和其他临床数据之间的相关性研究。受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线用于分析miR-320C或miR-6088对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

如表1所示，对NC、T2D和DN 3组患者的一般资料进行单因素方差分析，结果显示，3组患者的糖尿病病程、体质量指数(body mass index, BMI)、平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)、FPG、HbA1C、TC、TG、LDL-C、UAER和eGFR差异均有统计学意义(P<0.05)。对差异有统计学意义的指标进行两两比较，结果显示DN组和NC组之间在BMI、MAP、FPG、HbA1C、TC、TG和LDL-C比较差异有统计学意义(P<0.05)。DN组与T2D组相比，糖尿病病程、BMI、MAP、HbA1C、TG、LDL-C、UAER和eGFR均显著升高(P<0.05)。T2D组与NC组相比，MAP、FPG、HbA1C、TC、TG和LDL-C差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miR-320C和miR-6088在血浆中的表达

根据UAER的不同，105例DN患者被分为68例微量白蛋白尿(microalbuminuria,MA)患者(20 μg/min200 μg/min)。实时荧光定量PCR法检测miR-320C和miR-6088的表达， NC组、T2D组、MA组和CP组的miR-320C平均表达水平分别为2.01±0.37、3.06±0.78、3.83±0.49和4.39±0.52，miR-6088平均表达水平分别为1.18±0.30、1.60±0.27、1.80±0.31和2.15±0.32，详见图1。

表1 3组研究对象一般资料比较Tab.1 Comparison of general data of 3 groups

2.3 miR-320C， miR-6088与DN患者临床指标之间的相关性

为了研究miR-320C和miR-6088的临床意义，通过SPSS 20.0分析了DN患者miR-320C和miR-6088与其他临床指标之间的相关性。Pearson相关分析显示，miR-320C与UAER呈正相关(r=0.633，P=0.012)，与eGFR呈负相关(r=-0.544，P=0.004)，而与血浆HbA1C浓度(r=-0.130，P=0.185)、TG(r=-0.185，P=0.059)、LDL-C(r=0.012，P=0.906)、糖尿病病程(r=-0.116，P=0.239)和体质量指数(body mass index，BMI)(r=0.08，P=0.417)不相关。miR-6088与UAER呈正相关(r=0.571，P=0.001)，与eGFR呈负相关(r=-0.570，P=0.000)，而与血浆HbA1C浓度(r=0.040，P=0.684)、TG(r=0.033，P=0.738)、LDL-C(r=-0.084，P=0.392)、糖尿病病程(r=-0.186，P=0.058)和BMI (r=-0.033，P=0.737)不相关。详见表2和图2、3。

图1 miRNA-320C和miRNA-6088在不同人群中的表达Fig.1 Expression of miRNA-320C and miRNA-6088 in different populationsNC：normal control; T2D:type Ⅱ diabetic nephropathy; MA:microalbuminuria； CP：clinical proteinuria.

VariablesmiRNA-320CrPmiRNA-6088rPDM course-0.1160.239-0.1860.058BMI0.080.417-0.0330.737HbA1C-0.1300.1850.0400.684TG-0.1850.0590.0330.738LDL-C0.0120.906-0.0840.392UAER0.6330.0120.5710.001eGFR-0.5440.004-0.5700.000 DN:diabetic nephropathy; DM:diabetes mellitus; BMI:body mass index;HbA1C:hemoglobin A1C;TG:triglyceride;LDL-C:low density lipoprotein-cholesterol;UAER:urinary albumin excretion rates;eGFR:estimated glomerular filtration rate.

图2 miRNA-320C， miRNA-6088和DN患者UAER浓度呈显著正相关Fig.2 Positive correlation between the levels of miRNA-320C， miRNA-6088 and UAER in DN

2.4 miR-320C和miR-6088对DN的诊断价值

如图4所示，miR-320C的ROC曲线下面积(areas under the ROC curve, AUC)为0.834，miR-6088的面积为0.753。当miR-320C，miR-6088的血浆浓度为3.45和1.695时，约登指数最大，因此miR-320C的诊断阈值为3.45(灵敏度88.6%，特异度64.3%)和miR-6088的1.695(灵敏度77.1% 特异度60.7%)。

图3 miRNA-320C， miRNA-6088和DN患者eGFR浓度显著负相关Fig.3 Negative correlation between miRNA-320C， miRNA-6088 and eGFR levels in DN

图4 miRNA-320C和miRNA-6088诊断DN的ROC曲线Fig.4 ROC curves of miRNA-320C and miRNA-6088 for diagnosis of DNDN:diabetic nephropathy; ROC：receiver operating characteristic.

3 讨论

糖尿病是由多种因素引起的慢性和代谢性疾病，分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型糖尿病患者胰岛β细胞功能随着时间的推移逐渐下降，随之而来的是许多合并症。糖尿病肾病是糖尿病中最常见的损伤合并症，大约30%的Ⅱ型糖尿病患者会转化为DN，而约25%～45%的终末期肾病来自DN[10]。当DN患者发生肾功能衰竭时，不仅会给患者带来巨大的身体疼痛，也会给社会和患者家庭带来经济压力。因此DN疾病发展的早期诊断和及时准确的评估疾病进展是非常重要的。最近的研究[11]表明，由微血管疾病引起的肾小球硬化是DN患者最重要的临床特征，可以作为诊断DN的指标。营养治疗是DN治疗的重要措施之一[12]，一旦患者DN的诊断确定，随之进行个体化的营养治疗，包括根据透析与否及具体方式、频度等进行总体热量的设定，蛋白质、脂肪、碳水化合物能量配比，蛋白质种类和总量的设定以及运动方案的制定等一系列较无DN的糖尿病患者更为精细化的相关营养治疗，以求最大限度的保护肾功能[13-14]。因此DN的诊断成为无DN的糖尿病患者和DN患者营养治疗的分水岭，具有重要意义。本研究正基于此对DN早期诊断进行生物学标志物探究，以期早期干预，改善预后。

miRNAs是21到24个核苷酸组成的非编码小RNA，广泛存在于动物和植物中。miRNA可以通过降解或抑制mRNA的翻译来调节靶基因转录水平。同时，miRNA可以在血液或其他体液中稳定表达，并且在某些疾病中miRNA的表达会发生改变，如miRNA-21和miRNA-23a在儿童Burkitt淋巴瘤中上调[15]；miRNA-31在肺癌患者中的表达显著高于健康人，并与肺癌患者的生存时间相关[16]。近年来，一些研究表明miRNA与DN相关，MiRNA-23b在血浆和肾脏T2D患者中下调，并且在高葡萄糖环境的肾细胞中表达下调[17]。Putta等[18]报道miRNA-192在DN患者肾脏组织中表达上调，抑制miRNA-192的表达将有助于改善DN中的肾纤维化。另有文献[19]报道下调miRNA-21可减少DN炎性反应和足细胞的调亡。笔者认为miRNA不仅可以帮助了解DN的复杂病理，还可以作为诊断DN的生物标志物。

本文研究显示，DN患者血浆miR-320C和miR-6088的表达显著高于健康人群和T2D患者(P<0.05)。并且出现临床蛋白尿的DN患者血浆miR-320C和miR-6088的表达要显著高于微量白蛋白尿DN患者(P<0.05)。在DN患者中miR-320C和miR-6088的表达与UEAR呈正相关，与eGFR呈负相关。UAER和eGFR是诊断糖尿病肾病的两个关键指标，所以miR-320C和miR-6088可能是糖尿病肾病的潜在诊断指标。

mi-320C基因位于人染色体18q11.2上，与血管微环境[20]、癌症[21]和左心室重塑[22]密切相关。研究[23]表明，miR-320C参与了骨髓干细胞分化的调控，并且阻碍了膀胱癌细胞的增生、凋亡、迁移和侵袭[21]。mi-6088基因位于人染色体19q13.32上，是一个新发现的miRNA。目前关于miR-6088的研究很少，只是Deli等[8]报道尿液外泌体miR-6088在Ⅱ型糖尿病肾病患者中过度表达。从以上结果和叙述中可以看出，miR-320C和miR-6088与Ⅱ型糖尿病肾病相关。为了评估miR-320C和miR-6088对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值，笔者计算了miR-320C和miR-6088诊断Ⅱ型糖尿病肾病ROC曲线的AUC。本研究显示，miR-320C的AUC为0.834，诊断DN的灵敏度为88.6%，特异度为64.3%；miR-6088的AUC为0.753，诊断DN的灵敏度为77.1%，特异度为60.7%。此前有研究[24]显示miRNA-21作为DN诊断的潜在分子生物学标志物，诊断DN的灵敏度和特异度分别为76.0% 和 77.3%。miR-320C和miR-6088诊断DN的灵敏度均高于miRNA-21，但特异度较之略差。其次，本研究显示T2D组和NCXEGGMA组和T2D组，CP组和MA组比较，miR-320C和miR-6088的表达均显著升高，差异有统计学意义，且miR-320C和miR-6088与UAER均呈正相关，与eGFR均呈负相关。鉴于现阶段临床中DN的早期诊断仍然主要依靠UAER，故考虑miR-320C和miR-6088可能是DN潜在的早期生物学指标。本研究还显示当miR-320C、miR-6088的血浆浓度为3.45 pg/mL和1.695 pg/mL时，约登指数最大，故推测miR-320C的诊断阈值为3.45，miR-6088的诊断阈值为1.695。鉴于本研究研究例数有限，故仍需后续大量数据研究，再次验证和确定是否能以此阈值作为诊断DN的新生物标志物的标准阈值。

综上所述，血浆miR-320C和miR-6088在Ⅱ型糖尿病肾病中高表达，并与糖尿病肾病的严重程度密切相关，是Ⅱ型糖尿病肾病患者潜在的生物标志物。