昼夜温差处理下铁皮石斛原球茎松柏苷和紫丁香苷含量的测定

2019-06-11王丛巧王培育郭艳芳鲁瑶彭丽云陈青青林玉玲赖钟雄

热带作物学报 2019年2期

王丛巧王培育郭艳芳鲁瑶彭丽云陈青青林玉玲赖钟雄

摘要研究不同昼夜温差对铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量的影响，为开发铁皮石斛原球茎作为药材提供研究基础。采用光照培养箱设置不同温差处理，采用超高效液相色谱法测定松柏苷、紫丁香苷含量变化。建立同时测定松柏苷和紫丁香苷的超高效液相色谱法，以ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）为分析柱;流动相：1%乙酸水溶液（A）和甲醇（C）。正交试验研究提取方法，结果表明用纯水提取，料液比1∶40，提取1 h（每0.5 h震荡一次），2种物质提取率最高。采用此方法测定4个昼夜温差处理的铁皮石斛原球茎样品，结果表明，对照0 ℃温差松柏苷、紫丁香苷整体变化趋于平缓，8 ℃温差处理下，松柏苷和紫丁香苷在10 d的处理周期下都表现出含量增加，且明显优于其他处理。4 ℃温差处理两物质含量在第15天达到最高，12 ℃温差处理两物质含量前期高于对照处理，处理后期低于对照处理，且低于4 ℃、8 ℃温差处理。昼夜温差影响铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量，一定范围内的温差呈现促进作用，温差过大则出现抑制作用。

关键词铁皮石斛;原球茎;松柏苷;紫丁香苷;超高效液相色谱;昼夜温差

中图分类号 S-3 文献标识码 A

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属植物[1]，在中国乃至整个亚洲石斛作为一种中草药的药用价值均得到了重视。烘干成螺旋状的铁皮石斛叫“铁皮枫斗”，而今生物活性成分的测定和确认使“枫斗”的滋补功效更为显著[2]。野生铁皮石斛资源稀少而且濒临灭绝。铁皮石斛的一些活性成分如多糖、黄酮、生物碱是十分重要的药用成分[3-4]。

松柏苷和紫丁香苷属于苯丙素酚类物质，广泛存在于植物中，在黄皮[5]、椿皮[6]、丁香[7]、蛇菰[8]、天山雪莲[9]中均检测到松柏苷、紫丁香苷。松柏苷具有一定的抗氧化的作用[8]，紫丁香苷具有抗炎镇痛[9-10]、抗高血糖[11]、止血[12]和防辐射的作用[13]。李岩等[14]应用高效液相色谱法测定铁皮石斛中的酚酸类物质，周桂芬等[15-16]应用高效液相色谱法测定铁皮石斛中黄酮碳苷、柚皮素[17]，张淋洁等[18]、周桂芬等[19]等用高效液相色谱法测定铁皮石斛中单糖和多糖，使用高效液相色谱法存在耗时长、分离度差等缺点，测定过程需要耗费1～3 h[19-20]，而超高效液相色谱法（UPLC）具有高效、分离度高、峰形尖锐等特点[21]，已经成为次生代谢产物检测的有效工具。

近年来，国内外学者关于昼夜温差对作物影响进行了一系列的研究，证明昼夜温差[22]对作物光合[23]、生理特性[24]、花芽分化[25]、物質积累[26]及产量品质[27]等方面均有显著影响。温度的改变会导致植物光能利用率变化，从而影响生物量及果实碳水化合物的积累[28]。温度是植物体内物质积累的重要影响因子。陈艳秋等[29]对番茄的研究表明，昼夜平均温度不变的情况下，适当的昼夜温差有利于提高座果率和果实品质。郑卫杰等[30]在对文心兰的研究表明昼夜温差为15 ℃时最有利于干物质的积累和叶绿素的合成。杨博等[31]研究温差对非洲菊的影响，表明昼夜温差为9 ℃时最有利于可溶性糖的合成和干物质的积累。艾娟等[32]研究温度对铁皮石斛生长及生理特性的影响表明随着温差的增大叶绿素总量都呈现下降趋势。

组培技术的发展使其越来越多地应用到脱毒苗的生产、育种和药物及其他生物制剂的工业化生产中。何铁光等[33]认为利用原球茎代替成苗，并以组织培养物代替其原植株成为药源是实现野生石斛资源可持续利用的有效方式之一，这对拯救野生石斛资源有着极其重要的意义。在天山雪莲研究中，野生药材中紫丁香苷的含量远低于天山雪莲组织细胞培养物中的含量，采用组织细胞培养的方法大量生产紫丁香苷显示出前景[9]。

在铁皮石斛方面多糖[34-35]、生物碱[36]等次生代谢产物研究较多[37]，酚类[38-39]、木质素[40]的研究较少，温差对铁皮石斛松柏苷和紫丁香苷的研究也偏少。因此本研究采用原球茎为材料比较不同昼夜温差对铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷积累的影响，旨在找到最适合铁皮石斛原球茎松柏苷和紫丁香苷积累的温差，为开发铁皮石斛原球茎作为药材，大规模生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂铁皮石斛原球茎为福建农林大学园艺植物生物工程研究所保存。选取呈圆锥状、淡绿色、尚未分化的原球茎进行增殖培养。光照培养箱设置4个温差（昼/夜）处理，分别为0 ℃（25 ℃ /25 ℃）（对照），4 ℃（25 ℃/21 ℃），8 ℃（25 ℃ /17 ℃），12 ℃（25 ℃ /13 ℃），接种在1/2 MS+50 g/L土豆+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的培养基上进行培养，培养基pH 5.4～5.8，光照时间12 h/d，光照强度2000～2500 lx。

紫丁香苷（纯度98.84%），北京索莱宝科技有限公司;松柏苷（纯度98.9%），上海源叶生物科技有限公司。甲醇（色谱纯），德国默克股份两合公司;乙酸乙酯（分析纯）、乙酸（分析纯），太仓沪试试剂有限公司;无水乙醇（分析纯），上海沃凯生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备 Waters Acquity UPLC色谱仪，美国Waters公司;纯水器，厦门锐思捷水纯化技术有限公司;KQ-200SPDE型双频数控超声波清洗器，东菀市科桥超声波设备有限公司;IKA旋转蒸发仪、LGJ-25C冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制准确称取松柏苷和紫丁香苷标准物质各5.00 mg于5.00 mL 容量瓶中，分别用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL 的标准品母液，存放于棕色瓶中，?20 ℃保存备用。临用前，用色谱纯甲醇溶液采用逐级稀释法将标准品母液配制成一系列质量浓度的混合标准品溶液（1、3、5、10、30、50、100、300 mg/L）。

1.2.2 样品前处理以铁皮石斛0 ℃温差处理材料为样品，冻干粉碎制样过40目筛备用。参考李岩等[14]、黄相中等[41]、郑洁等[42]方法对提取劑类型、提取时间和提取料液比进行正交试验，优化铁皮石斛原球茎前处理条件，分别设计3个水平：提取剂：纯水、甲醇、70%乙醇;提取时间：1 h、1.5 h、2 h;料液比：1∶40、2∶40、3∶40，选择L9（34）正交表，将3个因素分别定为第1、2、3列，根据正交表安排进行试验，试验设计如表1所示。准确称取0.25 g样品至试管中，按比例加入提取剂，置于超声波振荡提取60 min（每0.5 h颠倒混匀一次），用离心机离心，取上清，用旋转蒸发仪蒸发至干;甲醇定容至10.00 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤后上机。

1.2.3 色谱条件色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温、流动相类型和流速参考冉玥等[43]和郑洁等[42]的方法。

1.3 UPLC分析方法的考察

1.3.1 线性范围和检出限在上述1.2.3色谱分析条件下，测定一系列质量浓度的标准溶液。以测得的各个酚类物质积分峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.2 精密度试验将同一标准混合溶液，按照1.2.3色谱条件连续进样6次，测定各标准物质的积分峰面积，以其为对象，计算其相对标准偏差（RSD）以考察色谱方法的精密度。

1.3.3 重复性试验按1.2.3方法连续重复测定同一实际样品，通过计算各成分的积分峰面积的RSD以考察方法的重复性。

1.3.4 稳定性试验按1.2.2方法制备同一样品溶液，在1.2.3色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h进样5 μL，测定样品中2种物质的含量。

1.3.5 加样回收率试验以铁皮石斛原球茎为试样，进行加样回收率试验，每个试验3次重复。根据样品中各酚类物质含量确定该种物质的加样量，按照1.2.2前处理方法及1.2.3分析方法进行试验，验证该方法的准确性。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 19.0软件以及DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 UPLC分析方法的建立

2.1.1 柱温和流动相的选择在1.2.3色谱条件下，优化比较后分别为柱温35 ℃、1%乙酸水溶液（A）和甲醇（C）流动相体系能使结构和性质相似的两种酚类物质能够分离，试验优化后确定的梯度洗脱条件为起始0% A;0～3 min 80% A;3 min 80% A;8～10 min 95% A。流速：0.20 mL/min，柱温：35 ℃;进样量为5.0 μL;波长扫描范围190～400 nm，定量波长为283 nm。

2种物质混合标准液及铁皮石斛原球茎样品色谱图见图1，根据保留时间并结合待测化合物的特征吸收波谱进行定性。总测定时间为10 min 一个样。由图1可以看出，2种酚类物质能完全基线分离，色谱峰形尖锐。因此，本方法适合铁皮石斛中松柏苷和紫丁香苷的同时测定。

2.1.2 样品处理方法的优化由表2结果的直观分析及表3对松柏苷提取量的方差分析结果可以看出，影响松柏苷总提取含量的因素：提取剂>料液比>提取时间，由k1、k2、k3值得出较优的

处理组合为以纯水做提取剂，提取1.5 h，最液比为1∶40。由表3可以看出，在置信概率为95%时，3个处理因素都对提取结果有显著性影响，其中提取剂的影响最显著。

紫丁香苷测定结果如表4所示。由方差分析结果可以看出，影响紫丁香苷总提取含量的因素：提取剂>提取时间>料液比，由k1、k2、k3值得出较优的处理组合为以甲醇做提取剂，提取1 h，最佳料液比为2∶40。由表5可以看出，在置信概率为95%时，提取剂和提取时间对提取结果有显著性影响，其中提取剂的影响最显著。

根据SPSS数据分析可得，对于2种物质提取来说，提取剂的处理中纯水和甲醇的差别不大，但显著优于70%乙醇;松柏苷提取比例1∶40和2∶40显著大于3∶40，紫丁香苷的3个比例之间差别不大;提取时间1 h和1.5 h差别不大且显著优于2 h。结合提取率和节约能源的角度考虑采用纯水做提取剂提取比例1∶40，提取1 h（每半个小时震荡一次），两种物质提取率最高。

2.2 UPLC分析方法的考察

2.2.1 线性范围和检出限松柏苷的回归方程Y=485624×X+3325.7（R2=0.9664），检出限为0.04 mg/kg。紫丁香苷的回归方程Y=12144×X+ 29.933（R2=0.96），检出限为0.005 mg/kg。在物质相应的线性范围内其质量浓度与积分峰面积呈现出良好的线性关系，相关系数均达0.9以上。

2.2.2 精密度试验如表6所示，2种物质的RSD分别为0.18和0.08，充分说明该方法具有较高的精密度。

2.2.3 重复性试验如表6结果显示，2种物质的RSD分别为0.17和0.08，说明该方法具有良好的重复性。

2.2.4 稳定性试验如表6样品中各物质的保留时间和含量的RSD值分别为0.49和0.13，表明供试品溶液在72 h内稳定，方法稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验试验结果显示，样品中

两物质的平均回收率分别为98.9%和95.1%，相对标准偏差在3.34和4.54，结果表明上述试验方法准确度较高，能应用于铁皮石斛中松柏苷和紫丁香苷这2种物质的同时检测分析。

2.3 昼夜温差对铁皮石斛样品中松柏苷、紫丁香苷含量的影响

2.3.1 昼夜温差对铁皮石斛原球茎松柏苷含量的影响由图2可知，各温差处理中，松柏苷的含量整体呈现先上升后下降的趋势，8 ℃温差处理在10 d达到最高值且显著高于其他处理和0 ℃温差对照，在15 d后其松柏苷含量有所下降。其他处理及0 ℃温差对照松柏苷含量在15 d达到顶峰，15 d时4 ℃温差处理的松柏苷含量最高，为204.78 mg/kg，是对照的1.33倍，大小依次为4 ℃温差处理>8 ℃温差处理>12 ℃温差处理>0 ℃温差处理。

2.3.2 昼夜温差对铁皮石斛原球茎紫丁香苷含量的影响由图3可知，各个温差处理中，紫丁香苷的含量整体呈现先上升后下降的趋势，在10 d

不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。

達到最高值，大小依次为8 ℃温差处理>12 ℃温差处理>4 ℃温差处理>0 ℃温差处理，且8 ℃的处理最高，为27.04 mg/kg。4 ℃温差处理在15 d达到最大值，且显著高于其他处理和对照。12 ℃温差处理变化较大，虽然在处理10 d中与其他处理无明显差异，但在15 d后的处理明显低于其他处理。对照在整个取样周期内紫丁香苷含量变化趋于平缓。

3 讨论

3.1 松柏苷和紫丁香苷的测定方法研究

酚类物质有着重要的生物和药理作用，周桂芬等[17]利用高效液相色谱法测定不同产地、不同年份的铁皮石斛中的柚皮素含量，需耗时50 min。使用高效液相色谱法测定铁皮石斛中黄酮类[44]物质，需耗时60 min同时测定6种混合样品。张淋洁等[18]用高效液相色谱法测定铁皮石斛中单糖和双糖，耗时40 min，为同时测定铁皮石斛中单糖和双糖提供方法。可见用HPLC法检测样品次生代谢产物存在耗时长的问题。

而本研究利用超高效液相色谱仪，建立了同时测、快速检测铁皮石斛原球茎中松柏苷和紫丁香苷的方法。以ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）为分离柱;流动相：1%乙酸水溶液（A）和甲醇（C），梯度洗脱，柱温：35 ℃;进样量为5.0 μL;波长扫描范围190—400 nm，定量波长为 283 nm。2种酚类物质在线性范围内呈现出良好的线性关系;分析时间仅为普通液相色谱法的1/6，有机溶剂使用减少，既降低成本，又减少污染环境。可以为其他处理样品测定提供参考方法。高效液相色谱法因其耗时短而广泛应用于游离氨基酸[45]、人参皂苷[46]、黄酮类[47]的测定。

现有研究通过正交试验比较了不同提取剂、提取料液比和提取时间对提取率的影响，结果表明采用纯水做提取剂，提取比例1∶40，提取1 h（每半个小时震荡一次），2种物质提取率最高，为铁皮石斛次生代谢产物大量提取奠定了基础。本研究中松柏苷含量范围为204.78～67.74 mg/kg，紫丁香苷含量范围为27.04～13.39 mg/kg。

3.2 温差对铁皮石斛松柏苷和紫丁香苷含量的影响

夜温对植物生长发挥重要作用，昼温较高夜温较低对植物生长有利。孙存华等[48]研究小麦得出昼温25 ℃、夜温15 ℃最利于其生长。在其昼夜温差促进小麦幼苗生长的酶学研究中说，昼夜变温条件下小麦幼苗淀粉酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶具有昼夜周期特性，因此变温条件下的小麦生长优于恒温条件下的生长。李莉等[49]在对番茄的研究表明与6 ℃温差相比10 ℃温差可显著提高部分品种番茄的产量和果实品质，表明番茄苗期生长温差不宜过大，温差过大易造成生长不良和减产。薄皮甜瓜最适宜的糖代谢边界温度为夜晚12 ℃，而降低3 ℃则严重影响其糖积累及代谢中的相关酶活性[50]。

温度是植物体内物质积累的重要因子，铁皮石斛适宜生长温度20 ℃[51]左右，在5 ℃停止生长，而幼苗在10 ℃以下容易受冻[52]。本研究中3个温差处理的结果表明，松柏苷和紫丁香苷整体都呈现先上升后下降的趋势，与对照0 ℃温差整体变化趋于平缓相比，8 ℃温差处理下，松柏苷和紫丁香苷在10 d的处理周期下都表现出含量增加，且明显优于其他处理，4 ℃温差处理两物质含量在15 d达到最高，12 ℃温差处理两物质含量前期高于对照处理，处理后期低于对照处理，且低于4、8 ℃温差处理。许多热带和亚热带植物，由于长期在温度较高的环境下生存，不能忍受0～10 ℃的低温，而常常发生冷害，从而对植物造成伤害。推测认为铁皮石斛是喜温暖湿润的环境、不耐寒的植物，夜间温度偏低，引发了植物体内物质代谢失调。

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