三角梅扦插枝化学诱变育种

常圣鑫 黄素荣 徐世松 杨光穗

摘  要  三角梅是一种重要的热带和亚热带观赏植物。由于三角梅有性繁殖困难，诱变育种是目前比较可行的育种方式。本研究采用甲基磺酸乙酯（EMS）、叠氮化钠（NaN3）和平阳霉素（PYM）3种不同类型诱变剂对‘伊娃夫人和‘马尼拉小姐2个三角梅品种扦插枝进行了化学诱变。研究发现‘伊娃夫人和‘马尼拉小姐20 h EMS半致死剂量分别为0.22%和0.62%。随EMS浓度增加，2个品种扦插枝发芽数和最长分枝长呈下降趋势，叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐增加;‘伊娃夫人叶片逐渐向暗色调变化，‘马尼拉小姐叶片向红色色调变化。20 h酸性NaN3处理下，‘伊娃夫人无法存活，‘马尼拉小姐成活率为82%～92%;随NaN3浓度升高，‘马尼拉小姐发芽数呈显著下降趋势。相比对照，20 h PYM显著提高了2个三角梅品种扦插枝最大分枝长度，但对扦插枝存活率无显著影响。中高浓度EMS和PYM处理‘马尼拉小姐三角梅出现了叶缘缺刻、叶表褶皱和双叶尖等变异株。

关键词  三角梅;甲基磺酸乙酯;叠氮化钠;平阳霉素中图分类号  S722.3+5      文献标识码  A

三角梅别名叶子花、宝巾花、勒杜鹃，为紫茉莉科（Nyctaginacea）三角梅属（Bougainvillea）植物的统称，原产南美洲的巴西和秘鲁等地，性喜阳耐高温。三角梅观赏性状突出，深受人们的喜爱，已被选为我国海南省省花，深圳市、厦门市、三亚市和屏东市等20多个城市的市花[1]。三角梅具有自交不亲和、杂交结实率低和杂交种雌雄不育或半不育的特点，因此，三角梅的遗传育种进展缓慢。诱变育种不依赖于有性繁殖，是目前较为理想的三角梅育种方式。辐射诱变在三角梅种质创新中应用最为广泛，印度国家植物研究所利用此方法已相继获得了‘阿朱那（B. ‘Arjun， 1974）、‘帕德米（B. ‘Pallavi，1987）、‘斑叶洛斯巴诺斯（B. ‘Los Banos Variegata，1987）、‘延瑟（B. ‘Jayanthi，2006）、‘斑叶花仙子（B. ‘Pixie Variegata，2009）和‘阿比希曼尤（B. ‘Abhimanyu，2010）等三角梅品种（印度国家植物研究所Banerji教授提供）。

化学诱变也是一种常用植物诱变育种方式，此方法利用化学诱变剂诱发基因突变或染色体重组，进而引起植株形态改变。常见化学诱变剂包括甲基磺酸乙酯（EMS）、叠氮化钠（NaN3）、平阳霉素（PYM）和秋水仙素等[2]。EMS是烷化剂类诱变剂，主要作用于DNA鸟嘌呤，可直接诱发DNA结构改变，诱变频率高、范围广[3];NaN3是点突变剂类诱变剂，主要作用于复制中的DNA，以碱基替换方式影响DNA合成，在酸性条件下诱变效率较高[4];PYM是抗生素类诱变剂，主要抑制细胞DNA合成，诱发染色体畸变，对人体毒性较低[5]。相比辐射诱变，化学诱变操作简便，适用性强。到目前为止，化学诱变在三角梅育种中的应用仅有2篇报道：一个是以叠氮化钠对一种三角梅品种扦插枝进行的诱变探索[6]，一个是以秋水仙素、氨磺乐灵和叠氮化钠对三角梅组培苗进行的诱变探索[7]。常见植物诱变剂，如甲基磺酸乙酯和平阳霉素等对三角梅的诱变效果尚不清楚，相同诱变剂对不同品种诱变效果是否一致也有待明确。本研究选用EMS、NaN3和PYM三种不同类型的诱变剂对2种三角梅品种扦插枝进行了化学诱变，评测不同诱变剂对2种三角梅品种的诱变效果及有效诱变计量，为三角梅化学诱变育种提供理论支持。

1  材料与方法

1.1  材料

供试三角梅品种为‘伊娃夫人（B. glabra ‘Mrs. Eva）和‘马尼拉小姐（B.  buttiana ‘Miss Manila），采集地点为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所三角梅种质圃。取一年生木质化枝条，修剪成10 cm左右扦插枝，每个扦插枝留2～4个营养芽。扦插枝生物学顶端削平面，下端削斜面待用。

1.2  方法

1.2.1  化学诱变剂配制  用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）和液態EMS（Nobleryder，北京）配制成浓度分别为0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%（V/V）的EMS处理液，诱变浓度梯度范围参考文献[8-10];用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 3.0）和1 mol/L NaN3（Solarbio，北京）配制浓度分别为0、2、4、6、8、10 mmol/L的NaN3处理液，诱变浓度梯度范围参考文献[6];用蒸馏水溶解82.4% PYM（太河制药，天津）配制成浓度为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%（w/V）的PYM处理液，诱变浓度梯度范围参考文献[11-12]。

1.2.2  扦插枝诱变  将准备好的扦插枝浸入上述不同浓度诱变剂处理液中，每个处理50个扦插枝，置于黑暗条件浸泡20 h，处理温度为25～30 ℃。浸泡后的材料用流水冲洗30 min，随机扦插入拱棚苗床中。苗床基质为珍珠岩∶椰糠（1∶1），温度范围为22～26 ℃，湿度在70%以上。31 d后，统计存活率（发芽且生根）;测定形态指标，每个处理测定3～6株重复（处理最低发芽3株）。

1.2.3  色差测定  使用ND110色差仪（Nippon Denshoku， Japan）测定不同处理植株倒数第四片叶（倒四叶）色差。先在黑色色板上调零，再在白色色板上进行白校准，将叶片置于白色挡板，避开叶脉区域，测定Lab值。L表示颜色亮度，取值0（黑色）～100（白色）;a表示红绿色素，取值-100（偏绿）～+100（偏红色），变化趋势为绿→灰→红;b表示黄蓝色度，取值范围-100（偏蓝色）～+100（偏黄色），变化趋势为蓝→灰→黄。每个处理4次重复。

1.2.4  光合色素含量测定  采集处理植株倒四叶（对于芽尖未伸展的处理，直接采集芽点）。剪取0.2～1.0 g鲜样，液氮固化，以3rd TGrinder磨样器（TIANGEN Biotech CO. LTD，Beijing）磨碎，加入8 mL 96%乙醇，斡旋混匀，室温暗处静置2 h。斡旋后，1 2000×g，离心10 min。使用U-2910 UV/VIS分光光度计（Hitachi，Japan）测定上清液在470.0、648.6、664.2 nm的吸光度。以96%乙醇稀释上清液，确保吸光值在0.2～0.8。每个处理3次重复。

叶绿素和类胡萝卜素含量测定参照公式[

式中，单位都为mg/g （FW）。A表示吸光度，L表示终体积，DF表示稀释系数，FW表示鲜重。

甜菜素测定参照公式[14]：

式中，BC单位mg/g。A表示吸光度，MW表示摩尔质量，DF表示稀释系数，表示摩尔消光系数，L表示比色皿光路长度（1 cm），FW表示鲜重。甜菜红素MW和分别为550 gmol/L和60 000 L/（mol×cm），测定波长为538 nm。

扦插枝半致死量（LD50）的计算：以不同诱变剂浓度x为自变量，不同浓度下的成活率y为因变量，在Excel 2016软件中进行线性方程（y= ax +b）拟合;依据方程LD50=（0.5-b）/a计算半致死计量。使用R 3.4.3软件进行测量值重复的单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan多重比较检验（p<0.05）。

2.1  三角梅扦插枝EMS诱变效应

在‘伊娃夫人扦插枝中，除0.4% EMS处理，其他EMS处理发芽率均显著低于对照，0.8% EMS处理发芽率最低;EMS处理最长分枝长均显著低于对照，0.6%和0.8% EMS处理最长分枝长最低。在‘马尼拉小姐扦插枝中，随着EMS浓度的增加，发芽率和最长分枝长均呈显著下降趋势（图3）。空白对照条件下，‘伊娃夫人发芽数大于‘马尼拉小姐，随着EMS浓度增加，‘伊娃夫人发芽数逐渐低于‘马尼拉小姐，说明‘伊娃夫人发芽数对EMS的耐受性较弱。空白对照条件下，‘伊娃夫人最长分枝长小于‘马尼拉小姐，在EMS的作用下，其最长分枝长依旧小于‘马尼拉小姐。

2.1.2  EMS剂量对三角梅叶片色差和色素含量的影响  随着EMS浓度增加，‘伊娃夫人叶片明度参数L值和色相参数b值逐渐降低，色相参数a值逐渐升高;0.6% EMS浓度处理下，L值相较对照降低34.8%，b值降低63.5%，a值升高45.5%（图5A）。这表明EMS处理使‘伊娃夫人叶片逐渐向暗色调、灰绿色调和灰黄色调变化。随着EMS浓度增加，叶绿素和类胡萝卜素含量显著增加，叶绿素a/叶绿素b没有显著变化，0.6% EMS浓度处理下，叶绿素含量相较对照增加57.6%，类胡萝卜素含量提高32.9%（图5B）。空白对照及EMS处理‘伊娃夫人叶片McIlvaine提取液在甜菜红素和甜菜黄素最高吸光波长附近（538 nm和478 nm）都无显著吸收峰（图6），表明‘伊娃夫人叶片不含或只含微量甜菜碱类色素。因此，叶绿素和类胡萝卜素含量变化是诱发EMS处理‘伊娃夫人叶片色调变化的主要因素。

随EMS浓度增加，‘马尼拉小姐叶片明度参数L值和色相参数b值呈先升后降趋势，色相参数a值逐渐升高，从-24.6（对照）增加到15.2（0.8% EMS），升高1.62倍，这表明‘马尼拉小姐叶片色调向红色、先深黄后灰黄、以及先明后暗的色调变化（图5C）。‘马尼拉小姐叶片光合色素变化趋势和‘伊娃夫人相似（图5D），不过，0.4%、0.6%和0.8%浓度EMS处理叶片McIlvaine提取液在甜菜红素吸光值538 nm处检测到吸收峰（图6），其经公式计算浓度分别达到（0.037±0.04）、（0.065±0.11）、（0.083±0.12） mg/g。因此，‘马尼拉小姐叶片色调的变化受到了光合色素和甜菜红素含量变化的共同影响。

A：EMS处理‘伊娃夫人叶片形态变异，左侧为未经EMS处理的扦插枝，右侧为EMS处理扦插枝;B：EMS处理‘马尼拉小姐開花变异，左侧为未经EMS处理的扦插枝，右侧表示EMS处理的扦插枝;C，D：EMS处理‘马尼拉小姐叶形变异;E，F：PYM处理‘马尼拉小姐叶形变异。

2.2  三角梅扦插枝NaN3诱变效应

在NaN3浓度梯度下，‘伊娃夫人扦插枝仅在2 mmol/L处理有3株发芽，且芽点很小。有趣的是，pH 3磷酸氢钾缓冲液空白对照也仅有3株发芽枝，这表明‘伊娃夫人对酸性条件敏感，扦插无法成活。在pH 3磷酸氢钾缓冲液空白对照条件下，‘马尼拉小姐三角梅成活率为80%，表明‘马尼拉小姐对酸性环境耐受性较高。在不同NaN3浓度下，‘马尼拉小姐成活率达到82%～92%，且变化不呈线性规律（图7A），表明2～10 mmol/L浓度范围内，NaN3对‘马尼拉小姐成活率没有显著影响。随NaN3浓度升高，‘马尼拉小姐发芽数呈显著下降趋势（图7B，图7C），但最长分枝数没有显著变化（数据不再展示）。此外，pH 3磷酸氢钾缓冲液空白对照条件下，‘马尼拉小姐三角梅叶绿素含量达到（2.31± 0.40） mg/g，类胡萝卜素含量达到（0.45±0.30） mg/g，甜菜素含量达到（0.028±0.006） mg/g，相较EMS空白都有显著提升;NaN3浓度梯度处理下，这些参数变化相较对照差异不显著（数据不再展示）。同时，NaN3处理下未发现叶形变异植株。

曲线最大吸光值均一化处理为1。甜菜红素标样（CAS number： 7659-95-2， TCI， Japan）McIlvaine溶液用于甜菜红素曲线测定，最大吸收峰为530 nm;‘加州黄金McIlvaine提取液用于甜菜黄素曲线测定，最大吸收峰在478 nm附近[14]。‘马尼拉小姐花苞片和红色叶片都为单峰，在538 nm附近，且在478 nm附近没有显著吸收峰，因此，认定为含有甜菜红素。‘马尼拉小姐绿色叶片及‘伊娃夫人叶片无显著吸收峰，不进行甜菜素计算。

2.3  三角梅扦插枝PYM诱变效应

不同浓度PYM对‘伊娃夫人和‘马尼拉小姐扦插枝存活率均无显著影响。随PYM浓度增加，2个品种发芽数也无显著变化，但是PYM处理扦插枝的最大分枝长均显著高于对照（图8C）。PYM处理‘伊娃夫人和‘马尼拉小姐扦插枝其他生理参数相较对照也无显著变化（数据不再展示）。不过，在0.6%～1.0%浓度PYM下，‘马尼拉小姐扦插枝均出现了10%左右的叶形变异株，主要表现为叶表褶皱和双叶尖变异（图4E，图4F）。

3  讨论

3.1  不同化学诱变剂诱变效果差异显著

EMS导致三角梅植株存活率下降，叶色变深，枝长变短，光合色素和甜菜素类色素含量增加，开花提前。张蒙蒙[8]对枇杷潜伏芽的EMS诱变研究发现随EMS浓度增加，枇杷潜伏芽萌发数逐渐降低，罗丽[9]对大红甜橙组培苗EMS诱变研究发现随EMS浓度增加，大红甜橙再生率逐渐降低，祁伟[10]对红掌组培苗EMS诱变研究发现红掌愈伤组织的褐化率随EMS浓度增加和处理时间延长呈上升趋势。这些研究表明EMS对植物生长都有较强的抑制作用。在红掌EMS诱变研究中，24 h EMS半致死计量为0.35%[10];在菊花EMS诱变中，8～10 h的0.8%～1.0% EMS处理为最佳诱变处理[15];甜橙研究中，2 h EMS半致死计量为1.8%[9];本研究中，20 h EMS处理2种三角梅半致死计量为0.22%和0.62%。这表明EMS最适诱变浓度范围在植物物种间一般在2%以下。

酸性NaN3使‘伊娃夫人扦插枝衰亡，但对‘马尼拉小姐三角梅扦插枝存活率没有显著影响，只是导致分枝数减少，光合色素和甜菜素类色素含量增加。陈庭等[6]利用NaN3对一种光叶三角梅扦插枝进行了化学诱变，发现诱变剂计量与成活率呈显著负相关，半致死计量为5.03 mmol/L。这表明酸性NaN3对不同品种三角梅的诱变效果不稳定。pH 3是NaN3最适诱变pH，但这样的酸度不适于多数植物生长，因此，NaN3诱变需以植株耐酸检测为前提。

通常认为PYM能抑制动植物细胞生长。王红等[11]发现PYM对叶片和茎段愈伤组织的诱导和分化有显著抑制作用，最适诱变浓度为2～4 mg/L，陈宇[12]发现PYM能抑制尾巨桉组培丛生苗生长，半致死浓度为23.7 mg/L。本研究发现PYM具有促进三角梅扦插枝生长的作用（至少在一定浓度范围内），同时也能诱发植株叶片变异。张瑞成等[2]也认为PYM不会对突变群体产生损伤。在本研究中，PYM叶形诱变效率与EMS相近，更高浓度是否能增强诱变效果，需要进一步测试。

3.2  遗传变异性状与生理性状的判定

强诱变剂EMS和NaN3都能使三角梅扦插枝发生剧烈的表型和生理变化，比如叶色变深，光合色素、甜菜素类色素含量增加，分枝数变化，开花提前等，这些变化多随诱变剂浓度增大而愈

A： 不同NaN3剂量下扦插枝的成活率;B：不同NaN3剂量下‘马尼拉小姐扦插枝的发芽数;C：不同NaN3剂量下‘马尼拉小姐扦插枝的生長。不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。

A：不同PYM剂量下‘伊娃夫人扦插枝的生长;B：不同PYM剂量下‘马尼拉小姐扦插枝的生长;C：不同PYM剂量下扦插枝的最大分枝长。不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。

发显著。这些表现与植物逆境胁迫应答的早期表现类似，比如在干旱胁迫初期，菊花叶色变深、叶绿素含量增加[16];紫外光胁迫下，植物叶片生长受抑制[17];盐胁迫下，盐地碱蓬叶片甜菜红素和类胡萝卜素显著升高[18];干旱胁迫下，柚子、柠檬等提前开花[19]。

实际上，EMS和NaN3除了会对植物遗传物质造成伤害，也会影响植物细胞的正常活力。EMS会与植物解毒物质反应产生一种有毒化合物，从而对植物产生损伤[2];NaN3需要在较高的酸性条件下才能发挥正常的诱变效应，而中强酸对大多数植物都是胁迫条件。因此，这2种诱变剂诱发的植物形态变化，不能排除生理性反应的可能。那么如何确定哪些形态变化属于生理性反应，哪些是可以稳定遗传的呢？一般而言，叶片构型的变化源于遗传物质的改变，比如Jaw-D、Strip-D或Mir164a-4基因导致拟南芥叶缘缺刻[20]，clf-18/clf-18基因导致拟南芥叶片内曲[21]，as1基因导致拟南芥不对称叶变异[22]，cu基因导致棉花杯状叶叶变异，rlrl基因导致棉花叶片圆形变异[23]。目前，尚未见生理因素直接诱发叶形变异的报道。植株生长、开花及色素合成过程等不仅受环境因素影响，也受植物遗传物质作用。比如IAA16基因突变导致拟南芥植株生长及开花迟缓[24]，OsCESA9基因突变导致细胞壁缺陷，抑制植株生长[25]，YGL2基因变异导致水稻叶绿合成通路受阻，叶片黄化[26]，CYP76AD3：dTmj1基因导致紫茉莉花瓣甜菜红素和甜菜黄素空间分布变异[27]。为了判定哪些变异是由于遗传物质变化引起的，可通过当代长期观察，子代观察等方法检测。在本研究中，通过对诱变处理半年期观察，发现叶形变异在叶片整个生长发育阶段都能稳定维持，小叶片和深绿叶发生早衰凋落，早花扦插枝在一季花期后转入营养生长阶段。由于化学诱变通常是点突变，形成的突变体多为嵌合体，为了避免变异部分脱落造成的材料缺失，也为了对变异特性的子代检测，还需利用组织培养方式对变异组织进行分离扩繁和土壤转植种植，通过长年观察进一步检测叶片变异及早花特性的稳定性。

3.3  化学诱变适于三角梅诱变育种

物理诱变是三角梅诱变育种领域长期采用的诱变方式。Gupta等[28]首次采用γ射线对三角梅扦插枝进行辐射诱变，发现γ射线显著降低了三角梅成活率，并诱发三角梅叶形变异，但不同计量射线对三角梅影响的差异不显著。陈庭等[29]发现在一定剂量范围内，辐射剂量与植株存活率呈负相关，与变异率呈正相关，进而计算了不同品种的半致死剂量，同时获得了叶卷曲、叶残缺、黄化叶等变异植株。孙丽娜等[30]发现低辐射剂量能促进三角梅枝条生长，中高辐射剂量对三角梅的抑制作用显著，同时发现少量芽变和叶变植株。Kishan等[31]研究发现随着辐射剂量的增加，植株成活率、成活株株高等生长指标逐步降低，同时发现了叶形变异植株。印度还通过物理诱变获得了大量的三角梅花型花色突变体[32]。

化学诱变在三角梅领域采用较少，本研究发现EMS和NaN3会产生与辐射诱变相似的生长抑制剂量效应，也出现了叶片变异等现象，而PYM可以在不对扦插枝产生生理性伤害的同时诱导突变。范芳绮[7]利用秋水仙素、氨磺乐灵、NaN3对5个三角梅品种组培苗进行了化学诱变，发现不同三角梅品种对化学诱变剂的反应差异显著，组培苗的成活率和发芽率随诱变剂处理时间和浓度的增加而降低，研究还获得了多株三角梅嵌合体，既包括花变异株，也包括叶变异株。陈庭等[6]利用NaN3对三角梅扦插枝进行了化学诱变，发现诱变剂剂量与成活率呈显著负相关，并分析了变异群体过氧化物同功酶的多态性。这些研究都表明化学诱变效果与辐射诱变效果相近，适用于三角梅诱变育种。在诱变实施过程中，为提高后代变异发生率，丰富变异类型，还可采用物理射线和化学诱变剂叠加施用，不同类型化学诱变剂叠加施用的策略[33]。

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