内源H2O2对水稻种子萌发的影响

肖羽 冯红玉 陈惠萍

摘  要  通过用不同浓度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）合成酶抑制剂碘二苯（diphenylene iodonium， DPI）及过氧化氢（hydrogen peroxide， H2O2）清除剂二甲基硫脲（dimethylthiourea， DMTU）分别培养水稻（Oryza sativa L.）种子，研究内源H2O2对种子萌发过程胚根、胚芽和胚根根尖活力等的影响。结果表明，DPI及DMTU培养的水稻种子其胚根生长和胚芽生长均受到抑制，尤其是DPI对胚根生长的抑制作用更为显著。DPI和DMTU对水稻种子萌发的影响均呈现出浓度效应，即浓度越高，抑制作用越强。其中，DPI对水稻种子萌发的抑制作用比DMTU的更为明显。此外，胚根根尖的超氧阴离子（superoxide anion， O2）和H2O2含量随DMTU浓度增大而减少，根尖细胞受损也越严重。由此推测，内源H2O2可能参与调控水稻种子萌发过程。

关键词  内源H2O2;种子萌发;DPI;DMTU

中图分类号  S511     文献标识码  A

种子萌发是指具有生活力的种子吸水膨胀后，胚根突破种皮的过程[1]。种子能否正常萌发对其后期是否能够正常生长发育，以及正常结实具有重要的作用。种子萌发受到外部和内部因素双重影响，外部因素主要包括光照、温度、水分等;内部主要受到自身基因、激素及活性氧等影响。

过氧化氢（hydrogen peroxide， H2O2）是植物正常生理过程产生的代谢产物，早先被认为仅是具有毒害作用的活性氧[2]。但近年的研究发现，适当浓度的H2O2可作为逆境信号分子，参与调控植物的抗逆性[3-4]。已有研究证实，外源H2O2可以提高铝胁迫下小麦根尖的抗氧化代谢水平，缓解铝胁迫导致的氧化损伤，从而增强小麦对铝胁迫的适应性[5]。适量的外源H2O2还可降低干旱下水稻糊粉层细胞内H2O2的含量，延缓糊粉层细胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）[6]，从而缓解干旱对水稻种子萌发的影响。

植物体内H2O2主要是由NADPH合成酶途径产生。碘二苯（diphenylene iodonium， DPI）作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）合成酶专一性抑制剂，预处理棉花种子会降低种子萌发率[7]。二甲基硫脲（dimethylthiourea， DMTU）是H2O2的清除剂，可降低H2O2含量，从而抑制莴苣种子萌发[8];DPI和DMTU均可减少干旱条件下水稻糊粉层中过量的H2O2，以提高淀粉酶活性，缓解干旱对水稻种子萌发的抑制作用[9]。DPI和DMTU还可降低中国石竹超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）活性[10]，影响山黎豆种子萌发和初生根生长[11]。

目前对于内源H2O2影响正常生长条件下水稻种子萌发的研究仍较少，因此，本研究用不同浓度NADPH合成酶抑制剂DPI和H2O2清除剂DMTU处理水稻種子，阐明其胚根和胚芽生长等萌发状况，并探究DMTU处理下胚根根尖超氧阴离子（superoxide anion， O2）含量和H2O2含量及细胞膜透性的变化，以期为进一步研究内源H2O2调控水稻种子萌发的机理奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

实验材料为水稻（Oryza sativa L.）杂交种‘博Ⅱ优767种子，购自海南儋州种子站。选取均匀饱满、大小一致、去除稻壳的种子50粒，放入垫有双层滤纸的培养皿中，并于光照培养箱进行培养。培养条件为：光照周期16/8 h（昼/夜），光照强度400 μmol/（m2·s），温度26 ℃。

1.2  方法

1.2.1  实验处理  实验设为13个处理：分别包括水（CK）、DPI和DMTU。其中，DPI设置6个浓度，分别为10、20、30、40、50、60 μmol/L，同样DMTU 也设置有6个浓度，包括10、20、30、40、50、60 mmol/L，每个处理设3次重复，每天更换对应的处理液。

1.2.2  胚芽长、胚根长观测及测量  分别于培养的24 h及48 h观测并拍照萌发水稻种子。培养3 d后，从每个处理中随机选取10粒种子，纯水洗净并用滤纸吸干表面水分，用直尺测量胚根长和胚芽长。

1.2.3  根系活性氧含量高低及质膜透性大小观察 参照氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazorium blue chloride， NBT）染色法[12]观察水稻种子胚根根尖O2含量。分别从各处理中随机选取培养3 d的萌发水稻种子，用手术刀切取根尖放入NBT染液（1 mmol/L，pH 5.8）中染色5 min，用纯水多次冲洗根尖，洗净后观察。

参照二氨基联苯胺（diaminobenzidine， DAB）染色法[13]观察水稻种子胚根根尖H2O2含量。同样随机选取培养3 d的萌发水稻种子，切取根尖于二氨基联苯胺染液（1 mg/mL，pH 5.8）中染色30 min后，用纯水洗净、观察。

参照伊文思蓝染色法[14]观察质膜透性大小。将萌发3 d水稻种子根尖放入0.125%伊文思蓝染液染色5 min后，取出用蒸馏水洗净观察。

以上水稻种子胚根根尖染色后，均采用Olympus（SZX7）体式显微镜观察并拍照。

1.3  数据处理

实验数据采用SPSS软件进行方差分析（analysis of variance， ANOVA），对处理间的差异性多重比较采用最小显著性差异法（least significant difference， LSD）进行分析，用Excel和Photoshop软件作图。

2  结果与分析

2.1  NADPH合成酶抑制剂DPI对水稻种子萌发中胚根生长和胚芽生长的影响

由图1可见，在水培养24 h后，水稻种子的胚根和胚芽均突破了种皮，而不同浓度DPI培养24 h后，只有10 μmol/L处理的种子稍微露出胚根和胚芽，20、30 μmol/L处理的仅露出胚芽部分，其余处理的胚根和胚芽均未露出。浸种48 h后，水培养的胚根远长于胚芽，10～30 μmol/L DPI处理的水稻种子仅露出一小段胚根，而40～60 μmol/L DPI处理的水稻种子则未见胚根露出。虽然不同浓度DPI处理下均可观察到胚芽，但随着DPI浓度的升高，胚芽长度逐渐缩短。以上结果表明，NADPH合成酶抑制剂DPI以依赖浓度效应影响水稻种子胚根及胚芽生长，且对胚根生长的影响效应远大于对胚芽的影响。

由于DPI对胚根生长抑制较严重，致使培养3 d的水稻种子大部分未有胚根露出，因此，本研究仅对DPI处理的水稻种子胚芽长度进行测量。从图2可知，与水培养的胚芽长度相比，不同浓度NADPH合成酶抑制剂DPI培养水稻种子3 d后，胚芽的长度受到明显的抑制，抑制率均超过50%，且随着处理浓度的递增，胚芽长度显著地递减。

由此可见，因DPI减少了水稻种子内由NADPH途径产生的内源H2O2，从而影响了水稻种子萌发过程胚根及胚芽的生长，尤其是严重抑制胚根的生长。这些结果表明了由NADPH途径产生的内源H2O2在调控水稻种子萌发中起着关键的作用。

2.2  H2O2清除剂DMTU对水稻种子萌发中胚根和胚芽生长的影响

如图3所示，不同浓度DMTU培养水稻种子24 h后，其胚根全部突破种皮，其中10 mmol/L DMTU处理的胚根长度与正常处理的较为接近，20 mmol/L DMTU處理的胚根长度与30 mmol/L DMTU处理的也极为接近，且均明显高于40～ 60 mmol/L DMTU处理的。同时，不同浓度DMTU处理的胚芽长度均明显不如正常处理的，其中，60 mmol/L DMTU处理的胚芽仍未伸长，10～ 30 mmol/L DMTU处理的胚芽长度较为接近，40 mmol/L及50 mmol/L DMTU处理的胚芽仅露出一点。水稻种子经过48 h培养后，10 mmol/L DMTU处理的胚芽及胚根长与正常处理的较为接近，20 mmol/L与30 mmol/L DMTU 处理的胚芽及胚根长度也较为接近，而50、60 mmol/L DMTU处理的胚根长度明显不如其他浓度DMTU处理的。由此可见，水稻种子经过不同浓度H2O2清除剂DMTU处理24 h或48 h后，萌发情况与DPI处理的相似，均呈现浓度效应，亦随着DMTU浓度增大，对胚根及胚芽生长的抑制作用越大。

H2O2清除剂DMTU培养水稻种子3 d后，水稻种子胚根长随着DMTU浓度依次递增而逐渐降低，且降低的幅度较为平缓（图4）。10 mmol/L DMTU处理的胚根长约为水处理胚根长的70%，从30 mmol/L开始，相邻浓度间胚根长依次减少0.3 cm左右（p<0.05，图4）。其中10 mmol/L DMTU处理的胚根长分别为40 mmol/L处理的2倍、50 mmol/L处理的3倍和60 mmol/L处理的5倍左右。

由图5可见，10 mmol/L DMTU处理对胚芽生长影响较小，在处理水稻种子3 d后，其胚芽长度仍为正常处理的88%。20、30 mmol/L DMTU处理对胚芽长度的影响较为接近，仅相差0.1 cm，约为正常处理的70%～65%，这两者间差异不显著。与正常处理相比，40 mmol/L DMTU处理的胚芽长度被抑制了50%，50～60 mmol/L DMTU处理对胚芽长度的抑制极其显著，其中60 mmol/L DMTU处理的胚芽长度仅为正常处理的30%（p<0.05）。

由此可见，清除种子内H2O2抑制了水稻种子萌发过程胚根和胚芽的生长，从而影响种子的萌发，表明水稻种子的萌发需要种子内一定量的H2O2参与。

2.3  H2O2清除剂DMTU对萌发水稻种子胚根根尖O2产生的影响

O2可与NBT反应生成蓝紫色不溶于水的显色物，其颜色深浅代表O2的含量高低，颜色越深，O2积累越多。由图6可以看出，正常处理的胚根根尖颜色最深，即其O2含量最高;10 mmol/L DMTU处理的胚根根尖颜色仅次于正常处理的，20～ 40 mmol/L DMTU处理的胚根根尖颜色随着浓度升高而变浅，表明O2含量随浓度升高而减少;50、60 mmol/L DMTU处理的胚根根尖仅被轻微染色。因此，随着H2O2清除剂DMTU浓度的升高，萌发水稻种子胚根根尖颜色逐渐变浅，即根尖O2含量随之减少，呈现出一定的浓度效应。

2.4  H2O2清除剂DMTU对萌发水稻种子胚根根尖H2O2产生的影响

植物体内H2O2被过氧化物酶分解后，可与DAB生成不溶于水的棕色产物，因此，根据颜色的深浅可以反映出细胞内H2O2含量的高低，颜色越深，H2O2的含量就越高。如图7所示，正常处理的萌发水稻种子胚根根尖染色最深，10 mmol/L DMTU处理的胚根根尖颜色比正常处理的的稍浅，说明10 mmol/L DMTU处理的胚根根尖H2O2含量与正常处理的较为接近，20、30 mmol/ L DMTU两者处理的根尖颜色也比较接近，50 mmol/L DMTU处理的根尖只有轻微染色，

60 mmol/L DMTU处理的胚根根尖几乎没染上颜色。因此，随着DMTU处理浓度越高，水稻种子胚根根尖染色越浅，且着色多集中于根尖前端，表明水稻种子胚根中H2O2含量与O2含量趋势相同，H2O2清除剂DMTU浓度越大，H2O2含量与O2含量越少。

2.5  H2O2清除剂DMTU对萌发水稻种子胚根根尖细胞透性的影响

伊文思蓝可进入细胞膜透性增大的细胞，蓝色深浅代表根尖细胞膜透性大小，颜色越深，细胞膜透性越大，表明细胞受伤害程度越高。从图8可见，随着DMTU浓度逐渐增大，萌发水稻种子胚根根尖伊文思蓝染色逐渐加深。正常处理的胚根根尖染色最浅，表明其细胞膜透性最小，细胞受伤害最轻;10～30 mmol/L DMTU处理的胚根根尖染色慢慢变深，即细胞膜透性逐渐增大;从40 mmol/L DMTU处理开始染色急剧加深，至60 mmol/L DMTU染色最深，说明此时细胞受伤害最严重。由此可见，随着DMTU浓度增加，伊文思蓝染色越来越深，表明胚根根尖细胞膜透性变大，即细胞受伤害程度逐渐增大，而根系活力逐渐变小，胚根正常生长受到一定的影响。

3  讨论

NADPH氧化酶存在于细胞质膜上，通过将NADPH中的电子转移给O2生成O2，然后由SOD将O2歧化成H2O2[3-4]。

在本研究中，不同浓度的NADPH氧化酶抑制剂DPI处理水稻种子后，其胚根长和胚芽长都受到明显抑制，并呈现出浓度效应，即浓度越高，抑制效果越明显。其中，20 μmol/L DPI处理的胚芽长度约为对照的45%左右，30～60 μmol/L DPI处理的胚根几乎不生长。孔祥强等[7]研究表明，用DPI预处理棉花种子后，种子内H2O2含量降低，萌发率也降低。此外，DPI处理绿豆幼苗外植体48 h后，不定根形成会完全被抑制，说明细胞中H2O2产生变少，导致绿豆不定根生长受阻[15]。本

研究结果显示，DPI作为NADPH合成酶专一性抑制剂可抑制由NADPH途径产生的内源H2O2，进而阻碍水稻种子萌发及生长，尤其是胚根的生长。因此，我们推断，由此产生的内源H2O2与水稻胚根生长发育紧密相关，并且可能是调控水稻胚根生长与发育的重要因子。

在本研究中，水稻种子经DMTU处理后，也呈现出浓度效应，即胚根及胚芽生长受到的抑制作用均随DMTU浓度递增而增强，且DMTU对胚根和胚芽的抑制作用相当。张凤芝等[8]的研究也证实，莴苣种子经DMTU处理后，因H2O2被清除，导致外源多鞍对种子萌发的促进作用降低，从而使种子萌发受到抑制。此外，对水稻种子胚根根尖染色观察分析结果也表明，随着DMTU浓度增大，H2O2含量及O2含量逐渐减少，而细胞膜透性却逐渐增大，即胚根根尖细胞受伤害程度加深。林莹等[16]研究与本研究结果相似，用NBT对大豆种子胚轴进行染色，正常种子萌发过程会产生O2，胚轴可被NBT完全染色，而老化的种子由于失去活力，萌发生长受到影响，导致O2产生较少，因此部分区域无染色。

在正常条件下，植物体内活性氧产生与清除处于动态平衡，因此，植物能维持正常生命活动，但一旦这种平衡被打破，其生命活动即受到影响。在本研究中，DPI和DMTU均显著影响水稻种子胚根和胚芽的生长，并且DPI比DMTU对水稻种子萌发的抑制效果更显著。张倩倩等[10]研究表明，DPI和DMTU有效地清除和减少正常条件下生长的石竹幼苗叶和根中O2和H2O2，并且这种效果在根中更为明显，这与本实验结论相一致。通过对本实验结果进行分析，我们推测可能水稻种子正常萌发所需的内源H2O2主要来自NADPH氧化酶途径产生的H2O2，而H2O2清除剂DMTU对水稻种子萌发的抑制效果不如DPI，可能是DMTU清除的H2O2中只有部分是来自由NADPH氧化酶途径产生的H2O2。本研究还证实DPI对水稻种子胚根的影响远大于对胚芽的影响，说明NADPH产生的内源H2O2主要是通过调控水稻种子胚根的发生来影响萌发。此外，DMTU因清除部分NADPH氧化酶途径产生的H2O2，因此，在一定程度阻碍了胚根及胚芽的生长，且胚根根尖O2含量和H2O2含量都有所减少，并引起根尖细胞损伤，从而使水稻种子的正常萌发受到影响。总之，维持内源H2O2产生与清除动态平衡对水稻种子萌发及生长至关重要。

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