枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化

焉兆萍 宋士良 陆克文

摘  要：本文对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化。采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化培养基为：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铵0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸亚   铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L。最适发酵条件为：初始pH 7.2，接种量5%，发酵温度35 ℃，摇床转速250 r/min。

关键词：枯草芽孢杆菌;发酵培养基;发酵条件

中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）01-0051-05

枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境;能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。枯草芽  孢桿菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2];其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。

本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。

1  材料与方法

1.1 供试菌种

枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。

1.2 培养基

LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水  1 000 mL，pH 7.2。

1.3 种子液的制备

将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。

1.4 液体种子生长曲线的测定

将液体种子以1%接种量分别接入盛有100 mL种子液体培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h、26 h和27 h，分别取样测其吸光度（OD600）。

1.5 发酵培养基的筛选及优化

选择12种不同发酵培养基进行筛选，种子液以2%接种量接入盛有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳发酵培养基[5-17]。

不同发酵培养基配方组成如下：

（1） 麦芽浸粉1 g/L、黄豆粉（过80目筛） 15 g/L、碳酸钙6.68 g/L、硫酸锰0.4 g/L、氯化镁2 g/L，pH 7.2。

（2） 可溶性淀粉10 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、硫酸镁0.2 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。

（3） 玉米淀粉15.86 g/L、玉米浆干粉12.68 g/L、氯化铵19.98 g/L，pH 7.2。

（4） 蛋白胨30 g/L、甘油10 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁1.5 g/L，pH 7.2。

（5） 玉米淀粉25.3 g/L、黄豆粉（过80目筛）49.5 g/L、酵母膏13 g/L、磷酸氢二钾1.1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、氯化钙0.1 g/L、硫酸锰0.1 g/L，pH 7.2。

（6） 葡萄糖15 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸镁5 g/L，pH 7.2。

（7） 酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、蔗糖12 g/L、氯化钠5 g/L，pH 7.2。

（8） 玉米淀粉15 g/L、玉米浆干粉12 g/L、酵母膏1.5 g/L、氯化铵3 g/L、硫酸镁0.3 g/L、硫酸锰0.15 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。

（9） 蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏粉5 g/L、磷酸氢二钾  2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L，pH 7.2。

（10） 豆粕20 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉10 g/L，pH 7.0。

（11） 豆粕20 g/L、葡萄糖5 g/L、玉米淀粉5 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸镁0.5 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸亚铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L、硫酸锰0.2 g/L，pH 7.0。

（12） 玉米淀粉20 g/L、蛋白胨5 g/L、豆粕10 g/L、硫酸铵0.5 g/L、碳酸钙1 g/L，pH 7.0。

1.6 发酵条件的优化

1.6.1 最佳培养温度的测定

采用筛选出的10号培养基，液体种子以2%接种量接入盛有100 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，分别在30 ℃、35 ℃、 37 ℃和40 ℃条件下，180 r/min摇床培养  72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳发酵温度。

1.6.2 最佳生长pH的测定

采用筛选出的10号培养基，发酵培养基初始pH分别调至6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，种子液以2%接种量接入盛有100 mL发 酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳初始pH。

1.6.3 接种量的影响

采用筛选出的10号培养基，将种子液接种量分别调节为摇瓶装液体积的1%、2%、5%、7%和10%，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适接种量。

1.6.4 装液量对细菌生长的影响

采用筛选出的10号培养基，種子液以2%接种量分别接入装有50 mL、75 mL、     100 mL、125 mL、150 mL液体发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适装液量。

1.6.5 摇床转速对细菌生长的影响

采用筛选出的10号培养基，液体种子以2%接种量接入盛有100 mL发酵培养基的      500 mL三角瓶中，37 ℃条件下摇床培养72 h，摇床转速分别设定为150 r/min、180 r/min、200 r/min和250 r/min，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适转速。

1.7 发酵培养基的优化

在确定好发酵培养基碳源与氮源的基础上，采用三因素三水平的正交试验表[L9（33）]进行试验。种子液以5%接种量接入装有   50 mL初始pH 7.2液体发酵培养基的500 mL三角瓶中，35 ℃条件下250 r/min摇床培养  72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数。

2  结果与分析

2.1 菌株生长曲线的测定

菌株在LB液体种子培养基中，37 ℃培养时间为23 h时的OD600为最大值，因此选择培养23 h为液体种子生长时间。

2.2 发酵培养基的筛选

培养基的筛选结果见表1。从试验结果可以看出，10号培养基摇瓶培养，细菌总数最高值为40.5亿CFU/mL。因此可选用10号培养基作为发酵培养基。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 培养温度对发酵菌数的影响

35 ℃培养发酵菌数最高，37 ℃次之，30 ℃和40 ℃条件下发酵细菌总数明显较低。因此，选择35 ℃为最佳发酵温度。

2.3.2 初始pH对发酵菌数的影响

摇瓶发酵中pH难以控制，一般控制其初始pH。初始pH 7.0时发酵菌数为35亿CFU/mL，初始pH 7.2时发酵菌数可达到39亿CFU/mL，明显高于其他初始pH的发酵菌数，因此选择适宜初始pH为7.2。

2.3.3 接种量对发酵菌数的影响

分别采用1%、2%、5%、7%和10%五个接种量梯度进行摇瓶培养。一定范围内，发酵菌数随接种量的增加而增加，5%接种量以上发酵菌数不再增加，因此5%接种量为最适接种量。

2.3.4 装液量对发酵菌数的影响

装液量越多发酵菌数越低。枯草芽孢杆菌为需氧菌，在一定培养条件下，装液量越少发酵菌数越高。因此选择最适摇瓶装液量为50 mL。

2.3.5 摇床转速对发酵菌数的影响

摇床转速越高发酵菌数越大。转速小，通气量小，不利于枯草芽孢杆菌的生长。因此该菌的适宜摇床培养转速为250 r/min。

2.4 发酵培养基的优化

碳源与氮源优化的正交试验因素水平  见表2，优化结果见表3。从表中可以看出，发酵培养基中豆粕、葡萄糖和玉米粉的用量对枯草芽孢杆菌的生长均产生一定影响，从极差R的大小来看，各因子作用的主次顺序为A>C>B，即豆粕的用量对菌体增殖的影响最为显著，玉米粉次之，葡萄糖影响最小。以发酵菌数作为评价指标，最佳表现组合为A2B1C2，即豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L为碳源、氮源用量的最佳组合。

3  结论

由试验结果可知，培养温度、培养基初始pH、接种量、摇床转速等培养条件和发酵培养基的组成对菌株的生长有很大影响。本文采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化发酵培养基组成为：豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L。最适发酵条件为：发酵温度35 ℃，初始pH 7.2，接种量5%，摇床转速250 r/min。采用此种配比发酵培养72 h后细菌总数可达162亿CFU/mL，本试验结果为大规模工业化发酵生产提供了有益借鉴。

参考文献：（17篇，略）