PCR结合核酸斑点杂交检测猪伪狂犬病毒

乌那尔汗·吉斯汗，任衍倍，孟凡峰，田似报，符玉涓，张继红，李 舵，美热木古丽，任 娟 ，林汉亮 ，崔治中 ,3,4，常 爽 ,3,4，赵 鹏 ,3,4

（1.新疆动物卫生监督所，乌鲁木齐 830000；2.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018；3.山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，泰安 271018；4.山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，泰安 271018）

猪伪狂犬病（Porcine pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）感染引起的一种高度接触性、急性传染病[1]。PRV最早于1813年在美国被发现[2]。猪是PRV的原发贮存宿主，能够长期贮存和排出病毒，在PR的传播中起着重要的作用[3]。猪伪狂犬病临床症状为发热、奇痒和脑脊髓炎，能够引起妊娠母猪繁殖障碍，流产，产死胎等；新生仔猪会出现神经症状、腹泻、呕吐、生长不良等，死亡率很高[4]。

PRV基因组为线性双股DNA，大小约150 kb，G+C含量高达73%[5-6]。gE基因是重要的毒力基因，对于病毒在宿主神经系统中的侵袭和扩散起着决定性作用[7]。gE基因的缺失会降低 PRV在神经系统中的感染和扩散，并且会提高动物的耐受性，使用时比较安全[8]。同时gE基因缺失对于病毒的复制和中和抗体的产生影响不大。因此，gE基因缺失苗在世界各国应用非常广泛[9]。

近年来，猪伪狂犬病在各个地区普遍流行，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失[10-12]。20世纪70年代以后，应用基因工程缺失疫苗和人工筛选的自然弱毒疫苗，使PR得到了有效地控制[13]。当前 PR防控主要依靠疫苗免疫，现有疫苗虽然能够减轻临床症状并减少排毒，但并不能预防潜伏感染。2011年PRV变异毒株的出现使猪PR在全国范围内再次流行[14]。因此，控制感染猪群并清除潜伏感染猪群等手段被广泛应用于 PR 防控。PR在临床症状上容易与一些其他疾病混淆，仅通过临床症状和病理剖检很难做出准确诊断，因此实验室诊断是PRV的重要诊断方法。PRV实验室诊断主要通过病毒的分离鉴定、PCR及血清学试验等方法。血清学诊断方法包括酶联免疫吸附方法（ELISA）和间接免疫荧光检测（indirect immunofluorescence assay，IFA）等[15-18]。血清学诊断对试验仪器要求较高，PCR检测往往存在假阳性或假阴性，一般需要通过测序进一步验证，而病毒分离检测时间过长。因此，建立一种快速、简便、灵敏度高、特异性强的可以鉴别诊断PRV野毒和gE基因缺失疫苗毒的检测方法，对PRV的防制和净化具有重要意义。本研究针对PRV的gE基因设计探针，建立了基于gE基因的PCR结合核酸斑点杂交检测方法，为该病的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒与病料 猪伪狂犬病毒SDTA2016株由本实验室分离鉴定和保存；在山东省不同猪场随机采集53份猪病料，研磨后按照天根DNA提取试剂盒操作说明书提取病料DNA，－80℃保存。

1.2 PRV探针的设计及制备 根据NCBI上已经发表的PRV的gE基因核酸序列，分别设计和合成了两对引物。以SDTA2016毒株的DNA为模板，用引物PRV-F2/PRV-R2（表1）扩增，构建重组质粒，命名为PRV-gE。以质粒PRV-gE为模板，利用引物PRV-F1/PRV-R1（表1），按照PCR DIG Probe Synthesis Kit（Roche，USA）试剂盒说明书标记PRV的gE基因DIG标记核酸探针。标记的gE基因核酸探针经凝胶回收纯化后进行定量，－80℃保存备用。同时引物PRV-F2/PRV-R2也用于样品组织DNA的常规PCR检测。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 PCR结合核酸斑点杂交检测 首先利用引物PRV-F2/PRV-R2对待检测样品的DNA进行扩增，对反应体系以及反应条件进行优化，确定最佳PCR反应体系（50 μL）：2×GC Buffer25 μL、dNTP4 μL、引物PRV-F2/PRV-R2各0.5 μL、模板1 μL、PrimeSTAR酶0.5 μL，ddH20补足50 μL。最佳反应条件：95℃预变性5 min；98℃变性10 s，60℃退火5 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃再延伸5 min。取2 μL PCR扩增产物点于尼龙膜上，按照DIG Nucleic Acid Detection Kit说明书并参照文献进行核酸斑点杂交检测[19]。

1.4 PCR结合核酸斑点杂交检测的特异性和灵敏性 对猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的cDNA以及猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）和PRV gE基因缺失疫苗株的DNA，运用建立的PCR结合核酸斑点杂交方法进行检测，检测该方法的特异性。将质粒PRV-gE进行定量后作倍比稀释，浓度分别为100 ng/μL～1 pg/μL，稀释的质粒作为模板，分别采用PCR和PCR结合核酸斑点杂交方法进行检测，比较这两种方法的灵敏性。最后，分别运用PCR和PCR结合核酸斑点杂交方法检测53份临床样品的DNA。

2 结果与讨论

2.1 PCR结合核酸斑点杂交特异性 用建立的PCR结合斑点杂交检测方法，对SDTA2016毒株、PRV gE基因缺失疫苗株、PCV2、CSFV、PEDV、PRRSV的PCR产物进行检测，并以灭菌的超纯水作为阴性对照。结果DIG标记的PRV gE基因探针，只与SDTA2016毒株的PCR产物反应呈阳性，而与PRV疫苗株和其他几种病毒的PCR产物以及超纯水反应均不显色（图1），显示出该方法具有较好的特异性。

图1 PCR结合斑点杂交检测猪伪狂犬病病毒的特异性试验Fig.1 Specifi city results of PCR-based dot blot hybridization technique for PRV

2.2 PCR结合核酸斑点杂交检测的灵敏性 运用建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法，对各稀释梯度的PRV-gE质粒进行杂交。PCR结合核酸斑点杂交检测显色到第5个梯度，并随着浓度递减颜色逐渐变淡，最低检出量为10 pg/μL（图2A）。运用PCR方法对各质粒进行检测，仅能检测到1 ng/μL（图2B），明显低于PCR结合核酸斑点杂交检测的灵敏度。

图2 PCR结合斑点杂交检测和普通PCR的灵敏性比较Fig.2 Sensitivity comparison of PCR-based dot blothybridization technique and normal PCR

2.3 PCR结合核酸斑点杂交检测在临床样品检测中的应用 应用引物PRV-F2/PRV-R2对53份病料先进行PCR扩增，电泳结果显示共有4份病料呈PRV阳性，阳性率为7.55%（图3A）。将PCR扩增产物点于尼龙膜上进行核酸斑点杂交检测，可见有5份样品显示阳性，比单纯PCR检出率高（图3B）。

本研究建立的PCR结合核酸斑点杂交检测的方法，可在一张尼龙膜上一次性检测大量的样本，操作简单，探针特异性好并可重复使用，对仪器设备要求比较低，并且相对于传统PCR和病毒分离鉴定等方法，灵敏性高，特异性强，用时较短。运用建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法对山东省部分地区收集到的53份病料进行检测，共检出5份阳性，检出率为9.43%，说明PRV在山东省仍有一定流行。

图3 临床样品的PCR检测和PCR结合核酸斑点杂交检测结果Fig.3 PCR and PCR-based dot blot hybridization detection result for clinical samples

从最初自然缺失gE基因的Bartha株到gE/TK基因双缺失及gI/gE/TK基因三缺失等疫苗株的出现，相对应的鉴别诊断方法一直在不断改变。利用分子生物学方法对PRV进行病原学检测，对于评价临床感染情况有着重要意义，可为兽医临床制定合理的免疫程序和净化程序提供重要参考。本研究建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法不仅显示了较高的灵敏度，更重要的是通过探针的严格把关确保了检测的特异性，节省了测序的时间，将在PRV的鉴别诊断和净化中发挥重要作用。