抗球虫新药沙咪珠利与鸡血浆蛋白结合率的测定

程晓蕾，陈桂平，王霄旸，王春梅，刘迎春，薛飞群，王 米，张可煜

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室，上海 200241；2. 江西省养蜂研究所，南昌 330052）

鸡球虫病（coccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）的一种或多种球虫寄生于鸡消化道引发肠道严重感染的一种原虫病，能导致鸡血便，饲料利用率降低甚至死亡，对养鸡业危害巨大[1]。多年来化学药物，如磺胺类、聚醚类、三嗪类等一直是防治球虫病的主要手段[2-3]。然而，随着这些药物在临床上的长期、反复使用，甚至滥用，球虫耐药现象非常普遍，即使是曾经被认为抗球虫最有效的地克珠利（diclazuril）也已显现出非常严重的耐药性问题[4-6]。此外，还有一些曾经被广泛应用的药物，近些年被发现具有严重的食品安全或环境生态毒性，因而被（或将被）禁止或限制使用。因此，人们能选择使用的抗球虫化学药物越来越少，寻求一种安全、高效，对环境友好、无交叉耐药的新型抗球虫药物成为当前抗球虫研究领域的重要任务[4,7-9]。

沙咪珠利（Ethanamizuril）是上海兽医研究所兽用抗感染药物创新团队设计合成的新型三嗪类化合物。已有研究结果显示，沙咪珠利起效剂量为5 mg/kg，添加剂量达9 mg/kg以上时，抗球虫指数（anticoccidial index, ACI）稳定在185～200之间，属于高效抗球虫药物[6,10-12]。沙咪珠利无致畸、致癌、致突变等毒性作用，对环境生物影响小，安全范围广，抗球虫效果好，具有广阔的应用前景[11-13]。药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一，影响着药物在机体的分布、代谢、消除和排泄，与药物的药理、毒理作用强度密切相关[14]。但是，沙咪珠利的蛋白结合特征目前仍未见相关研究报道。本研究利用平衡透析法模拟沙咪珠利与鸡血浆蛋白结合过程，探索其蛋白结合特征，为进一步指导沙咪珠利的新药研究以及临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 沙咪珠利对照品（含量≥99.8%）由中国农业科学院上海兽医研究所兽用抗感染药物创新团队合成；地克珠利、妥曲珠利（含量≥99%），上海维编科贸有限公司；健康鸡由无任何药物饲料饲养至4周龄，经心脏采血离心后获得鸡血浆，－20℃保存；DMSO、乙腈、乙酸乙酯、磷酸、氯化钠、磷酸二氢钾等均为分析纯化学试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）购自Fisher公司；磷酸氢二钾（分析纯）购自上海实验试剂有限公司。

1.2 仪器与其他 高效液相色谱仪（HPLC）：2695型，购自美国Waters公司（配Waters 2487检测器）；氮吹仪：N-Evap型，购自美国Organomation Associates公司；涡旋混合器：XW-OA型，购自上海医科大学仪器厂；离心机：Micro CL 17/21型，购自美国Thermo公司；微孔滤膜：0.22 μm，购自上海安谱实验科技有限公司；34MM透析袋购自美国biosharp公司（MWCO∶14000）。

1.3 溶液的配制 药物储备液的配制：准确称取20 mg沙咪珠利和20 mg妥曲珠利，分别置于10 mL容量瓶中，然后用乙腈溶解并定容至刻度；准确称取20 mg地克珠利置于10 mL容量瓶中，然后用DMSO溶解并定容至刻度。分别得到2000 μg/mL的沙咪珠利、妥曲珠利和地克珠利储备液，置4℃冰箱中密封保存。取适量储备液用乙腈分别稀释至所需浓度即为不同浓度的标准工作液。

空白透析液的配制：分别称取2.59 g磷酸二氢钾、14.11 g磷酸氢二钾和1.99 g氯化钠置于1 L容量瓶中，加水稀释并定容，得到pH为7.4的磷酸盐缓冲透析液。

1.4 样品预处理 透析内液（血浆）200 μL置于2 mL离心管中，加入乙酸乙酯1200 μL，涡旋混合60 s，静置后4℃、14 800×g离心 15 min，转移有机层，氮气吹干，流动相复溶，涡旋30 s，经0.22 μm微孔滤膜过滤，置于进样瓶中，进样量为10 μL，经HPLC检测。透析外液的处理同上。

1.5 标准曲线的制备 透析内液：在200 μL空白血浆中加入沙咪珠利标准溶液，配制成血药浓度为0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL的标准样品。按1.4所述方法预处理后进行HPLC检测。依照峰面积和对应浓度做图，求得回归方程。

透析外液：在200 μL空白透析液中加入沙咪珠利标准溶液，配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL，按1.4中方法预处理，然后进行HPLC检测。依照峰面积和对应浓度做图，求得回归方程。

1.6 色谱条件 色谱柱：Diamonsil 5μm C18, 250 mm×4.6 mm；保护柱：EasyGuard C18 10 mm×4.6 mm；流动相：甲醇∶0.2%磷酸水（65∶35）等度洗脱；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30℃；紫外检测波长：251 nm。

1.7 精密度和回收率 透析内液：取空白血浆200 μL，按1.5中方法操作，制备高（100 μg/mL）、中（20 μg/mL）、低（1 μg/mL）3个浓度的血浆样品系列，每个系列5个平行样品，按1.6中色谱条件进行检测。相同的方法每日重复测定3批，连续3日，计算回收率及精密度。

透析外液：取200 μL空白透析液，按1.5中方法操作，制备高（10 μg/mL）、中（1 μg/mL）、低（0.1 μg/mL）3个浓度的样品系列，每个系列5个平行样品，按1.6中色谱条件进行检测。相同的方法每日重复测定3批，连续3日，计算回收率及精密度。

1.8 平衡透析实验 透析袋用透析外液活化后取出，一端折叠后用棉线扎紧，从另一端加入1 mL空白血浆，排除透析袋中空气后将此端也折叠夹紧。将透析袋悬浮于沙咪珠利浓度分别为1、5、10 μg/mL的30 mL透析液中，每个浓度5个平行，4℃条件下，透析至平衡。透析完全后，用10%的高氯酸检查透析内液是否渗出，出现浑浊者弃用。

1.9 透析袋的吸附率 采用文献[15]中方法，将1 mL（V1）空白透析液加入到活化好的透析袋中，放置于含有沙咪珠利浓度（C1）分别为1、5、10 μg/mL的30 mL（V2）透析外液中，每个浓度5个平行，放置于4℃冰箱中。待平衡后分别取透析外液进行检测，得出药物浓度C2。

1.10 蛋白结合率测定 分别测定透析袋内药物质量浓度ρA（总质量浓度）和透析外液药物质量浓度ρB(游离药物质量浓度），根据公式计算血浆蛋白结合率：F=（ρA-ρB）/ρA。

1.11 透析温度对结合率的影响 透析袋中加入1.0 mL空白血浆后，悬浮于沙咪珠利浓度分别为1.0、5.0、10 μg/mL的30 mL透析液中，每个浓度5组，分别放入4℃、20℃、37℃的恒温培养箱中透析，每组5个重复，直到透析平衡。测定透析袋内药物浓度A（总浓度）和透析外液药物浓度B（游离药物浓度），按1.10中公式计算蛋白结合率。

1.12 沙咪珠利与血浆蛋白的结合竞争 按1.8的方法制备含沙咪珠利浓度分别为1.0、5.0、10 μg/mL，同时含地克珠利或妥曲珠利浓度为5.0 μg/mL的透析样品，放置于4℃，直到透析平衡。每个沙咪珠利浓度3个重复，分别检测沙咪珠利、地克珠利、妥曲珠利与血浆蛋白的竞争结合。将装有1.0 mL空白血浆的透析袋悬浮于含沙咪珠利浓度分别为1.0、5.0、10 μg/mL的30 mL透析液中，透析平衡作为对照。平衡后测定透析袋内药物浓度A（沙咪珠利浓度）和透析外液药物浓度B（游离沙咪珠利浓度），按1.10中公式计算蛋白结合率。

1.13 数据处理 数据用平均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS17.0统计软件对数据进行方差分析。比较各浓度组间、不同温度和竞争条件下沙咪珠利与鸡血浆蛋白结合率的差异。

2 结果

2.1 检测方法的专属性 透析内液（空白血浆）、空白透析液与对应加标液样品按1.4中方法处理后经HPLC进样检测的色谱图，以及10 μg/mL地克珠利标准液、10 μg/mL地克珠利与沙咪珠利的混合标准液、10 μg/mL的妥曲珠利标准液、10 μg/mL的妥曲珠利与沙咪珠利的混合标准液经HPLC进样检测的色谱图如图1所示。透析内液血浆（空白血浆）、空白透析液中的物质、地克珠利、妥曲珠利对沙咪珠利无干扰，方法专属性良好。

图1 沙咪珠利含量检测的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the determination of Ethanamizuril

2.2 标准曲线和线性范围 分别以药物浓度（X）和对应峰面积（Y）进行统计回归，透析内液的回归方程为：Y=34177X+9717.8，R2=0.9999。根据标准曲线可知透析内液中沙咪珠利在0.5～100 μg/mL范围内线性关系良好，方法的定量下限为0.5 μg/mL。透析外液的回归方程为：Y=4380.2X+8770.6，R2=0.9998。透析外液中沙咪珠利在0.1～10 μg/mL范围内的线性关系良好，方法的定量下限为0.1 μg/mL。

2.3 回收率及精密度 透析内液（血浆）以及透析外液中分别添加高、中、低3个浓度沙咪珠利标准工作液，每个浓度平行测定5个样品，3日内重复3次的回收率及精密度如表1所示。从表1可知，透析内液（血浆）的回收率在94.35%～111.8%之间，日内精密度在1.16%～8.16%之间，日间精密度在4.85%%～7.35%之间；透析外液回收率在91.7%～104.4%之间，日内精密度在1.07%～4.33%之间，日间精密度在1.83%～3.32%之间。方法的回收率及精密度良好，符合生物样品的测定要求。

表1 沙咪珠利的回收率和精密度检测结果（n=5）Table 1 Recovery and precision results of Ethanamizuril (n =5)

2.4 平衡时间的确定 将1 mL空白血浆置于透析袋中，于4℃在含1 μg/mL沙咪珠利的透析外液中放置0、24、38、44、52、62、68、76、86、92、98 h，取透析外液测定药物浓度。以透析外液药物浓度达到平衡时的时间为透析平衡时间。结果在52 h后各检测时间点透析外液药物浓度差异无显著性统计学意义，考虑透析的完全以及透析时间，试验透析时间设定为72 h。

2.5 透析袋吸附率 结果显示，透析袋对沙咪珠利有微量吸附，但对血浆蛋白结合率检测结果无显著影响（表2）。因此可以采用此透析袋在实验条件下进行沙咪珠利血浆蛋白结合率的测定。

表2 透析袋的吸附率（n=5）Table 2 Adsorption rate of dialysate membrane (n=5)

2.6 沙咪珠利血浆蛋白结合率 4℃条件下，1、5、10 μg/mL浓度的沙咪珠利血浆蛋白结合率在92.17%～97.72%之间，血浆蛋白结合率随药物浓度的升高而呈下降趋势，高浓度药物与低浓度药物的血浆蛋白结合率差异具有显著性统计学意义（P<0.05），药物浓度在1～10 μg/m L之间血浆蛋白结合率时具有一定的浓度依赖性。20℃条件下，1、5、10 μg/mL浓度的沙咪珠利血浆蛋白结合率在91.80%～97.47%之间，变化规律与4℃条件类似。37℃条件下，1、5、10 μg/mL浓度的沙咪珠利血浆蛋白结合率在78.63%～85.12%之间，血浆蛋白结合率也随药物浓度的升高而降低，但差异并无显著性统计学意义（P>0.05）。与4℃和20℃相比较，37℃条件下，相同药物浓度的血浆蛋白结合率降低，差异具有显著性统计学意义（P<0.05），这可能与长时间平衡后蛋白在37℃条件下易降解有关（表3）。

2.7 沙咪珠利与血浆蛋白的结合竞争 沙咪珠利和其他三嗪类药物在4℃与鸡血浆蛋白的竞争结合结果见表4。沙咪珠利浓度为1.0、5.0、10.0 μg/mL时与浓度为5.0 μg/m L的地克珠利竞争后，与同浓度的沙咪珠利对照组相比，鸡血浆蛋白结合率升高，差异具有显著统计学意义（P<0.05）；而与妥曲珠利的竞争结果也与地克珠利类似，血浆蛋白结合率升高，差异具有显著统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

药物与血浆蛋白的结合主要通过离子键、氢键、疏水性结合及范德华力结合，一般是一种可逆过程。通常只有游离型药物才能通过脂膜向组织扩散，被肾小管滤过或被肝脏代谢。因此，药物与血浆蛋白的结合会明显影响药物分布、消除以及药物作用的持续时间。本研究表明，沙咪珠利属于高血浆蛋白结合药物，且血浆蛋白结合率具有一定的浓度依赖性，由此可以推测沙咪珠利的半衰期较长。药动学研究发现沙咪珠利在鸡和大鼠体内的消除半衰期都在10 h以上[12]，与本研究结果相符。

表3 沙咪珠利的血浆蛋白结合率Table 3 The plasma protein binding rate of Ethanamizuril

表4 沙咪珠利的血浆蛋白竞争结合率Table 4 The plasma protein competition binding rate of Ethanamizuril

药物在血液中的分布平衡并非始终恒定，它会随环境温度、pH值、离子强度、蛋白含量等因素的变化而变化。本研究结果显示，与4℃环境相比，沙咪珠利与鸡血浆蛋白结合率在20℃环境下变化不大，而在37℃会显著降低，推测可能是由于体外长时间的透析和较高的温度使血浆蛋白发生了降解。当几种药物同时使用时，还必须考虑药物间结合竞争力的大小，以便较好预测各药物在体内的游离浓度。同类药物由于取代基的不同，与血浆蛋白结合率也会不一样[16]，一般同类药物由于竞争会使药物的蛋白结合率降低。本研究中地克珠利和妥曲珠利可以协同沙咪珠利的蛋白结合率升高，这可能是由于血浆蛋白在小分子结合过程中具有“柔性”（flexibility），两者结合时空间构象变化引起的[17]。

药物的血浆蛋白结合率测定是新药临床前研究的重要内容之一，平衡透析法是血浆蛋白结合常用的经典参比方法[14]。本研究建立了沙咪珠利血浆蛋白结合率的HPLC检测方法，采用平衡透析法首次开展了沙咪珠利的血浆蛋白结合率研究，为进一步了解沙咪珠利的药动学特性和临床应用奠定了基础。