双指标评价核桃蛋白酶法增溶改性

张 汆 刘 洋 陈志宏 储晶晶 何晓伟

(滁州学院生物与食品工程学院，滁州 239000)

核桃(JuglansRegiaL.)属胡桃科植物，其种子与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃自汉代传入中国，2010年中国核桃种植面积及总产量超越美国， 2017年，中国核桃产量为189万t，占世界总产47%，居世界第一[1]。核桃仁中含有丰富的油脂(65%～70%)、蛋白质(14.6%～19.0%)、碳水化合物(5.4%～10.0%)、磷脂、维生素和矿物质等营养组分[2-3]。核桃油中不饱和脂肪酸含量丰富，如，油酸11.5%～25%、亚油酸50%～69%、亚麻酸6.5%～18%等总量90%以上，是一种高档、保健型的膳食油脂[4-6]。

脱脂后的核桃饼粕是优质的膳食蛋白资源，其中蛋白质以水不溶性的谷蛋白(70.11%)和醇溶蛋白(5.33%)为主[3,7]。由于核桃蛋白中75%以上的都是水不溶性蛋白质，使其分离提取和在食品中的应用受到限制，因此，如何有效提取核桃饼粕中的蛋白质、提高其溶解性是核桃蛋白研究的主要内容。

目前，脱脂核桃饼粕中蛋白质的分离提取方法多为酶法，这方面的研究报道很多，所用的酶主要有：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶等[8-12]。利用酶法水解脱脂核桃饼粕制备各种核桃肽是目前的研究热点[10]。肽类易吸收、有一定保健功效，但是分子量较小的肽类不仅不易保存，易被氧化、易吸湿、潮解，而且丧失了蛋白质的一些功能性质，如黏度、起泡性、乳化性等[13，14]。因此，为了获得一种既能提高核桃蛋白溶解度，又能保持其作为大分子功能特性的方法，本研究在分析木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶对脱脂核桃粉中蛋白质水解的基础上，选择一种复合酶解方法，可明显提高核桃蛋白的溶解性，为核桃蛋白在食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

部分脱脂核桃粉，食品级。

磷酸盐、水合茚三酮、氯化亚锡等，均为分析纯试剂。

耐高温α-淀粉酶(4万U/g，食品级)，木瓜蛋白酶(200万U/g)、菠萝蛋白酶(120万U/g)、风味蛋白酶(80万U/g)。

1.2 主要仪器设备

DHS16-A型水分测定仪，1601160S型杜马斯燃烧仪，T6型可见分光光度计，LG-10B型真空冷冻干燥机，A300型全自动氨基酸分析仪，YRE-301型减压旋转蒸发仪等。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

脱脂：将部分脱脂的核桃粉粉碎(过60目筛)，以石油醚(30～60 ℃)为脱脂溶剂，采用索氏脂肪提取仪连续脱脂处理6～8 h后，挥发有机溶剂后，即可得到脱脂核桃粉(Defatted walnut flour，DWF)。

去淀粉：将DWF与水按1 ∶10比例混合搅拌，经过95 ℃水浴加热糊化15 min，取出、降温至50～60 ℃时，加入1.5%耐高温α-淀粉酶，水解2 h后，95 ℃灭酶(20 min)、离心(4 000 r/min，5 min)，沉淀水洗2～3次，最后冷冻干燥、粉碎(过60目筛)，此为脱脂脱淀粉核桃粉(Defatted and destarch walnut flour，DDWF)，备用。

1.3.2 营养组分分析

常规组分分析：水分，采用直接干燥法(GB/T-9695.15—2008)测定；脂肪，索氏提取法(GB.5009.6—2016)测定；蛋白质，杜马斯燃烧法(GB 5009.5—2008)测定；灰分，马弗炉直接灰化法 (GB 5009.4—2016)测定；淀粉含量：采用酸水解法(GB 5009.9—2016)。

氨基酸组分：采用全自动氨基酸分析仪测定[2]。

水解度(Degree of hydrolysis，DH，%)：采用茚三酮比色法测定[15-16]。采用茚三酮比色法测定酶解液中游离氨基酸含量，然后按照以下公式计算DH：

式中：m1为酶解液中游离氨基酸含量，g；m2为样品质量，g；p为样品中蛋白质含量，g/100 g。

可溶性固形物含量(Soluble solids，SS)：采用直接干燥法测定[17]。酶解结束后，灭酶，离心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，用去离子水定容至100 mL，混匀，吸取5.0 mL，放入干净铝盒内，在105 ℃下干燥至恒重。取出，在干燥器内冷却，称量。酶解液中可溶性固形物(SS)含量按照下列公式计算：

式中：m1为5.0ml酶解液中的可溶性固形物含量，g；m2为样品质量，g；100/5为稀释倍数。

1.3.3 酶解方法

根据实验设计，将一定量的DDWF放入容器，加入水，搅拌均匀，加入酶，在设定温度下酶解一定时间。酶解结束后，在95 ℃下灭酶15 min，离心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，定容，分析测定其水解度(DH)和可溶性固形物(SS)。

1.3.4 速溶核桃蛋白粉制备

DDWF在适宜条件下酶解，所得酶解液冷冻干燥，粉碎后，即为速溶核桃蛋白粉(Instant walnut flour，IWF)，装袋，备用。

1.3.5 吸水性和吸油性测定

参考文献[13]和[20]中的方法，略有改动。称取3 g蛋白样品，放入离心管中，然后加入10倍量去离子水(或大豆色拉油)，搅拌均匀后，25 ℃下静置30 min，离心(4 000 r/min，5 min)，倒出上清液，倒扣离心管在吸水纸上，以去掉离心管内壁附着的水(或油)。然后，称量，减去离心管质量，则用蛋白吸水(或吸油)后质量与蛋白样品质量之比表示其吸水性(或吸油性)，单位为g/g。

1.4 数据处理方法

试验数据采用Excel分析整理，绘制图表；采用SPSS数据处理软件对处理见差异显著性进行分析。所有实验数据均重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 核桃饼粕及蛋白粉主要营养组分

DWF、DDWF及IWF中主要组分如表1所示。结果显示，实验所购脱脂核桃饼粕中含71.71%的蛋白质，仍残留14.11%的油脂。经脱脂后，蛋白质质量分数提高至79.70%，残留油脂0.95%，淀粉质量分数从9.90%提高至13.78%。采用耐高温α-淀粉酶处理后，DDWF中的蛋白质质量分数提高至86.84%，淀粉质量分数降至2.27%。此外，脱脂、去淀粉处理，对于核桃蛋白粉的吸水性和吸油性，影响均不显著(P≤0.05)，但是经蛋白酶增溶改性后所得IWF的吸水性和吸油性显著高于酶解前(P≤0.05)(表1)。

目前关于核桃仁中淀粉的相关信息，文献报道很少，具体分子结构及其功能特性还需深入研究。Savage G P 曾经测定过15种不同产地核桃仁中淀粉质量分数(1.1%～2.8%)[2]。由此推测，当脱去62.6%～70.3%的脂质后，淀粉质量分数在3%～10%范围内。本实验所得结果与之接近。

表1 核桃饼粕及蛋白粉主要组分含量分析

注：表中除水分含量以外，其他组分均为干基含量；表中同一行数据上角标注的相同字母表示无显著差异，不同大写字母表示差异极显著(P≤0.01)，不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)。

几种核桃蛋白粉中氨基酸组成分析如表2所示。结果显示，核桃蛋白粉中含量最高的氨基酸为谷氨酸和精氨酸，鲜味氨基酸(Glu、Arg)和甜味氨基酸(Gly、Ala、Ser、Lys、Met)含量总和接近50%，所以核桃蛋白粉的口感鲜甜，苦味不明显。酶法增溶改性使核桃蛋白含量略有降低，但是其必需氨基酸含量略有增加(表2)。

表2 不同核桃蛋白粉中的氨基酸组成/%

2.2 核桃蛋白单酶水解

2.2.1 木瓜蛋白酶

图1是底物浓度、酶浓度、酶解温度和时间等因素对木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的影响趋势。结果显示，所有因素中，DH和SS都显示出非常一致的变化趋势。随着底物浓度的增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低趋势(图1a)；随酶用量增加，DH和SS含量均呈几乎线性增加(图1b)；在30～70 ℃范围内，DH和SS含量在60 ℃时达到最高，70 ℃时因高温使酶部分失活而使DH和SS明显降低(图1c)；随酶解时间延长，DH和SS含量均呈增加趋势，在3～4 h后，增幅明显减缓(图1d)。出于酶解效率、蛋白溶解度和成本等方面考虑，确定木瓜蛋白酶对核桃蛋白的适宜酶解条件为：底物质量分数12%，酶用量1.0%，在60 ℃下水解4 h，在此条件下，核桃蛋白DH为3.09%，SS质量分数30%。

图1 木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的单因素实验结果

2.2.2 菠萝蛋白酶

图2是底物浓度、酶浓度、酶解温度和时间等因素对菠萝蛋白酶水解核桃蛋白的影响趋势。结果显示，随着底物浓度增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低趋势(图2a)；随酶用量增加，DH和SS含量均呈几乎线性增加(图2b)；在30～70 ℃范围内，DH和SS含量在50 ℃时达到最高，此后因高温使酶部分失活而使DH和SS明显降低(图2c)；随酶解时间延长，DH和SS含量均呈增加趋势，在3～4 h后，增幅明显减缓(图2d)。因此，综合考虑后确定菠萝蛋白酶适宜酶解条件为：底物质量分数12%，酶用量1.0%，在50 ℃下水解4 h。在此条件下，核桃蛋白DH为2.20%，SS质量分数25%。显然，菠萝蛋白酶对核桃蛋白的水解效果略逊于木瓜蛋白酶。这是因为菠萝蛋白酶是一种高选择性内切酶，优先水解碱性氨基酸(例如精氨酸)或芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸)的羧基侧上的肽链[18-19]。

图2 菠萝蛋白酶水解核桃蛋白的单因素实验结果

2.2.3 风味蛋白酶

底物浓度、酶浓度、酶解温度和时间等对风味蛋白酶水解核桃蛋白的影响趋势如图3所示。结果显示，随着底物浓度的增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低的趋势(图3a)；随酶浓度增加，DH和SS含量均呈线性增加(图3b)；在30～70 ℃范围内，DH和SS含量在50 ℃时达到最高，此后因高温使酶部分失活而使DH和SS明显降低(图3c)；随着酶解时间延长，DH和SS含量均呈增加趋势，在3～4 h后，增幅明显减缓(图3d)。因此，综合考虑后确定风味蛋白酶的适宜酶解条件为：底物质量分数12%，酶用量1.0%，在60 ℃下水解4 h，在此条件下，核桃蛋白水解度为1.71%，可溶性固形物质量分数18.33%。

图3 风味蛋白酶水解核桃蛋白的单因素实验结果

单酶水解的因素分析结果显示，在适宜的条件下，木瓜蛋白酶的酶解效果最好，其次是菠萝蛋白酶，风味蛋白酶水解效果最差。这与各种酶的酶解特性有关。风味蛋白酶一般由米曲霉发酵制得，含有氨肽酶、羧肽酶，属外切酶，通过末端水解多肽键，其水解产物多为游离氨基酸，一般用来改善酶解物风味[19-20]。就以上单酶水解结果而言，可溶性固形物最高也只有30%，相应水解度为2.20%。还不能达到核桃蛋白增溶改性目的。

2.3 核桃蛋白复合酶解

不同蛋白酶酶解位点不同，对蛋白质的水解效果也不同。因此，复合酶解理论上可以获得比单酶更高的酶解效果[11]。三种蛋白酶不同组合下的酶解结果见表3。复合酶解中，除了酶用量有调整外，其他酶解条件为：底物质量分数12%、温度50 ℃、酶解时间4 h。结果显示，就SS而言，在总酶用量1.0%条件下，组合1>组合9>组合5。这表明，在核桃蛋白酶是水解中，①木瓜蛋白酶起主导作用，减少其用量，会降低核桃蛋白水解效果。在木瓜蛋白酶用量增加的情况下，核桃蛋白的DH和SS都有明显增加(见表3)，该结果与上述单酶水解结果一致(图1、图2和图3)。此外，相同酶用量下，酶组合①+②与①+③相比，后者的核桃蛋白虽然具有较高的 DH，但是SS却低于前者。该结果与③风味蛋白酶的酶解特性有关：它是通过水解蛋白质分子末端肽键，其产物为游离氨基酸，所以对DH的影响较大，但是对SS的影响不大。

表3 不同酶组合对核桃蛋白的水解结果

注：表中①木瓜蛋白酶，②菠萝蛋白酶，③风味蛋白酶。

表3中的组合13和组合12相比，增加了②菠萝蛋白酶用量，核桃蛋白DH和SS不增反降(表3)，这似乎说明在三酶复合酶解体系中，存在竞争性水解：菠萝蛋白酶用量的增加，抑制了木瓜蛋白酶的水解。是抑制了木瓜蛋白酶的活性，还是占据了木瓜蛋白酶的作用位点？具体抑制机理还需要进一步研究。从组合14-16可以看出，随着③风味蛋白酶用量增加，DH虽有明显增加，但SS增幅不大。这也进一步印证了③风味蛋白酶外切酶的酶解特性。

综合表3结果，SS值最高的组合12(①1.2%+②0.4%+③0.2%)，相应的DH为5.57%，SS为48.33%；其次是组合4(①1.5%+②0.5%)，相应的DH为5.36%，SS为47.50%。采用这两种酶组合制备的速溶核桃粉(IWF)中蛋白质质量分数83.26%，略低于DDWF中的86.84%，吸水性和吸油性得到显著改善，分别提高了68.99%和52.48%(表1)；IWF中必需氨基酸质量分数11.77%，略高于DDWF中的11.11%(表2)，达到了DDWF增溶的目的。当然，若继续增加复合酶解中酶的用量，酶解效果会更好，但是考虑到成本，酶用量一般不宜超过3%。

2.4 酶解双指标的相关性分析

本研究中对于核桃蛋白水解效果的评价采用了水解度(DH，%)和可溶性固形物(SS，%)两个指标。其中，DH是在蛋白质被催化水解时所裂解肽键数目的基础上表示蛋白质水解情况其测定方法有：OPA 法、TNBS法、TCA法、pH- Stat、甲醛固定法、茚三酮比色法等多种，且不同方法间差异较大[15-16]。文中采用的是茚三酮比色法，为更加准确、便捷地评价核桃蛋白增溶效果，文中采用酶解液中可溶性固形物含量(SS，%)作为第二个评价指标。与DH相比，SS测定方法更简便、快速和准确。

图4和表4结果表明，4种酶解条件下，DH和SS间均呈现显著的线性正相关，相关性最高的是菠萝蛋白酶(R2=0.879 9)，其次是复合酶(R2=0.843 9)和木瓜蛋白酶(R2=0.757 0)，风味蛋白酶相关性最低(R2=0.638 5)。即便是相关性最低的风味蛋白酶，其相关性也已达到极显著水平(P=0.000 1)。因此，文中采用DH和SS双指标评价核桃蛋白酶法增溶效果是合适的。与DH测定相比，SS测定方法非常简便、快速，可直接反映核桃蛋白的溶解性。

图4 不同蛋白酶水解过程中DH与SS间的相关性

表4 不同蛋白酶水解过程中DH与SS间的相关性

3 结论

以核桃蛋白水解度(DH)和酶解液中可溶性固形物(SS)含量为指标，对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶等三种酶的单酶水解、复合酶解进行分析比较，得到核桃蛋白增溶改性适宜的酶解条件是：木瓜蛋白酶1.2%+菠萝蛋白酶0.4%+风味蛋白酶0.2%，底物质量分数12%，50 ℃下酶解3 h。在此条件下所得速溶核桃粉DH为5.57%，SS为48.33%，其中蛋白质质量分数83.26%，吸水性和吸油性得到显著改善，分别提高了68.99%和52.48%，达到了DDWF酶法增溶改性目的。

DH和SS间相关性分析结果表明，DH和SS间存在极显著相关性。说明DH和SS双指标评价核桃蛋白酶法增溶效果比DH单指标评价更加可靠，SS可与DH一起评价核桃蛋白的酶解效果或酶解程度。