表没食子儿茶素没食子酸酯和米糠蛋白的相互作用

苗向硕 吴 伟 吴晓娟

(中南林业科技大学食品科学与工程学院；稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙 410004)

米糠是稻谷籽粒的精华所在，虽然只占稻谷质量的6%～8%，却集中了64%的稻谷营养素和90%以上的人体必需元素。米糠含有11%～17%的米糠蛋白(Rice bran protein，RBP)，是一种重要的植物蛋白资源。RBP过敏性低，其氨基酸组成与FAO/WHO推荐的氨基酸组成的理想模式非常接近，生物效价高，是一种公认的优质植物蛋白，可广泛应用于包括婴幼儿食品在内的各类食品中[1]。

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶儿茶素中的主要成分，约占儿茶素的50%～80%，EGCG因其高含量和优异的生物活性而被认为是茶多酚中最重要的成分[2-3]。EGCG具有良好的抗氧化性，其淬灭自由基的能力比维生素C和维生素E还要强，由于EGCG安全无毒且抗氧化作用很强，使得食品在较长时间保持其原有的色泽和营养水平，有利于延长食品保质期、改善食物品质。因而广泛应用于焙烤食品、糕点、乳制品、肉制品及水产品等[4]。

EGCG在食品体系中会与蛋白质发生相互作用，进而改变蛋白质的结构特征和功能特性，因此EGCG和各类食品蛋白质相互作用成为研究热点。目前已有报道主要集中于EGCG与动物蛋白(牛乳铁蛋白[5]、牛血清蛋白[6]和β-乳球蛋白[7])相互作用的研究，鲜有关于EGCG与植物蛋白相互作用的研究报道。近年来富含RBP和EGCG的食品在国内外均有报道[4, 8, 9]，但缺乏RBP与EGCG相互作用机制方面的研究，本研究采用荧光光谱、紫外-可见光谱研究RBP与EGCG相互作用，为开发富含RBP和EGCG食品及调控此类食品品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜米糠、EGCG(纯度≥98%), 其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Sorvall LYNX 6000高速落地离心机、FD5-4冷冻干燥机、F4600荧光分光光度计、Blue Star紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 RBP提取

参考吴伟等[10]方法提取RBP。新鲜米糠除杂过40目筛，随后与正己烷以1 ∶5(g ∶mL)料液比混合脱脂，重复脱脂五次。将脱脂米糠和去离子水以1 ∶10(g ∶mL)混合，用2 mol/L NaOH溶液调pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下搅拌提取4 h，随后以8 000 r/min在4 ℃下离心20 min，取上清液用2 mol/L HCl调pH至4.0，静置20 min后在4 ℃条件下以8 000 r/min离心20 min得到RBP沉淀，水洗RBP沉淀3次后将沉淀分散于5倍体积的去离子水中，用2 mol/L NaOH溶液调pH至7.0，采用截留分子量3 500 u的透析袋透析24 h脱盐，最后冷冻干燥得到RBP。

1.3.2 荧光光谱测定

取2 mL浓度为1.5mg/mL的RBP溶液加入10 mL试管中，随后加入梯度体积2 mg/mL的EGCG溶液，再用pH 7.0的0.02 mol/L 的磷酸盐缓冲液定容至3 mL，使得最终RBP浓度为1 mg/mL，并得到质量比为(1 ∶0，1 ∶0.02，1 ∶0.04，1 ∶0.06，1 ∶0.08，1 ∶0.10，1 ∶0.12，1 ∶0.14，1 ∶0.16，1 ∶0.18，RBP ∶EGCG)的RBP-EGCG混合液，充分混匀后，分别在17、27、37 ℃的恒温水浴锅中保温5 min。在激发波长为290 nm，发射波长为300～500 nm，激发和发射狭缝宽度分别为5、10 nm ，扫描速度1 200 nm/min的条件下测定RBP荧光光谱。

1.3.3 同步荧光光谱测定

样品制备同1.3.2，测定温度为300 K，分别固定 Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，激发和发射的宽度分别为5、10 nm，扫描速度1 200 nm/min，扫描250～450 nm范围内的同步荧光光谱。

1.3.4 三维荧光光谱测定

样品制备同1.3.2，起始激发波长为 200 nm，激发波长设置在200～350 nm的范围内，发射波长设置在200～500 nm的范围内，激发和发射狭缝宽度分别为5、10 nm，扫描速度1 200 nm/min，每隔10 nm记录1次，共扫描 31 次。

1.3.5 紫外-可见光谱测定

取3 mL质量浓度为1 mg/mL的RBP溶液于石英比色池中，扫描250～350 nm波长范围内的吸收光谱。扫描完毕后，将不同质量浓度的EGCG-RBP混合液充分混合后加入到比色池中，放置5 min后扫描吸收光谱，测定温度为300 K。以相同质量浓度的RBP溶液作空白，记录RBP溶液的紫外-可见吸收差谱。

1.3.6 EGCG与RBP结合距离的测定

EGCG溶液紫外光谱的测定步骤：移取3 mL质量浓度为0.03 mg/mL的EGCG溶液于石英比色池中，紫外吸收光谱的波长扫描范围为 300～500 nm。RBP溶液荧光光谱的测定步骤：移取3 mL质量浓度为1 mg/mL的RBP溶液于石英比色池中，设置激发波长为290 nm，发射波长为300～500 nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5、10 nm，扫描速度1 200 nm/min，测定温度为298 K。

2 结果与分析

2.1 EGCG与RBP相互作用的荧光光谱

2.1.1 EGCG浓度对RBP内源荧光光谱的影响

蛋白质内源荧光反映RBP中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基微环境的变化，进而能够表征EGCG对RBP结构的影响[4]。由于EGCG荧光发射信号非常弱，对RBP荧光信号的干扰可以忽略，因而本研究中不考虑“内滤光效应”的干扰问题[11]。如图1所示，随着EGCG浓度的增加，一方面RBP的荧光强度明显下降，说明EGCG和RBP之间存在较强的相互作用；另一方面RBP最大发射峰从358.4 nm逐渐红移至 377.2 nm，表明随着EGCG浓度的增加，RBP中芳香族氨基酸残基微环境由疏水性逐渐向亲水性转变，说明RBP空间结构逐渐处于更加延伸的状态[12]。

注：RBP质量浓度为1 mg/mL；1～10 分别表示EGCG质量浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL。图2、图4同。

2.1.2 EGCG浓度对RBP同步荧光光谱的影响

同步荧光光谱可表征EGCG对RBP中酪氨酸残基和色氨酸残基微环境的变化，Δλ=15 nm 时仅显示酪氨酸残基的光谱特征，Δλ=60 nm时仅表现色氨酸残基的荧光[5]。由图2可以看出，随着EGCG浓度的增加，RBP色氨酸和酪氨酸残基的同步荧光强度降低，且色氨酸残基的荧光淬灭程度更大，表明EGCG对RBP的荧光淬灭主要作用于色氨酸残基。当Δλ=15 nm时，酪氨酸残基最大发射波长为368.4 nm，随着EGCG浓度的增加没有发生明显变化；当Δλ=60 nm时，随着EGCG浓度的增加，色氨酸残基最大发射波长由288 nm逐渐红移至292.2 nm，表明EGCG和RBP作用时主要影响的是色氨酸残基微环境。

图2 不同浓度EGCG对RBP同步荧光光谱的影响

2.1.3 EGCG浓度对RBP三维荧光光谱的影响

三维荧光光谱中的峰位、指纹信息和荧光强度可以科学、可靠地反映蛋白质的组成分布和特征构象变化。图3中可以看出，峰A表示瑞利散射峰(Ex=Em)，峰B是二级散射峰(Em=2Ex)，峰1代表RBP的色氨酸残基产生的特征峰，峰2代表多肽链主链结构的特征峰，这些都是三维荧光光谱中的典型峰[13]。如图3所示，随着EGCG浓度的增加，峰1的颜色变浅，轮廓线更细，等高线变得稀疏，说明EGCG可使得RBP荧光强度显著降低，表明EGCG与RBP之间发生了强烈的相互作用。加入EGCG后峰2等高线变得密集，区域面积发生变化，表明EGCG-RBP复合物的形成使得蛋白质多肽链的骨架发生变化，蛋白的结构发生改变。由表1可知，色氨酸残基的最大发射波长发生红移，表明色氨酸残基所处环境的疏水性逐渐降低，极性增加，与同步荧光光谱的结果一致。EGCG使得峰A和峰B的荧光强度降低的原因可能是EGCG与RBP结合后，破坏了RBP表面的保护水层，RBP变得更加分散，引起RBP粒径变小，光散射作用减弱，从而使这两个散射峰的荧光强度减弱，这说明EGCG与RBP之间形成了不发光基态复合物。

图3 未添加EGCG(a)和EGCG添加浓度为0.08 mg/mL(b)的RBP的等高线图

表1 EGCG-RBP体系三维荧光光谱的特征参数

2.2 EGCG与RBP相互作用的紫外-可见吸收光谱

由图4可知，随着EGCG浓度的增加，RBP吸光度逐渐升高，出现明显的增色效应，同时，最大吸收峰波长发生红移，由280 nm增加至302 nm，表明EGCG与RBP相互作用引起了蛋白质结构变化，形成了基态复合物。结合前面荧光光谱结果推测，EGCG-RBP复合物最大吸收峰波长的红移，可能是由于EGCG使RBP中色氨基酸残基发生位移或被结合，形成新的共轭体系，使π-π*跃迁能量增大[14]。

图4 不同浓度EGCG对RBP紫外-可见吸收光谱的影响

2.3 EGCG与RBP相互作用机制

2.3.1 荧光淬灭机制

由荧光光谱可知，EGCG对RBP荧光具有明显的猝灭作用，通过对其淬灭机制分析，可以更准确地判断EGCG与RBP是否形成了复合物[11]。荧光淬灭机制可分为动态淬灭、静态淬灭和动态静态混合淬灭3种。动态猝灭是由荧光团和猝灭剂之间的碰撞引起的，随着温度升高，动态猝灭常数会增大。静态猝灭是由于荧光团和猝灭剂之间形成了基态复合物，由于复合物的稳定性通常会随着温度升高而下降，因而其猝灭常数则会随温度升高而降低[11]。因此，可利用Stern-Volmer方程[7]求解不同温度下EGGC和RBP相互作用的淬灭常数，从而判断其淬灭机制。

Stern-Volmer方程如下：

(1)

式中：F0是未加入EGCG时的荧光强度；F是加入EGCG时的荧光强度；[Q]为EGCG浓度/mol/L；Kq为双分子猝灭过程速率常数[L/(mol·s)]；Ksv为动态猝灭常数/L/mol；τ0为猝灭剂不存在时荧光体的寿命(生物大分子的平均寿命约为10-8s)。

根据式(1)，以 [Q]为横坐标作图，F0/F为纵坐标，得到不同温度下 EGCG 对RBP猝灭的Stern-Volmer 曲线(图5)。由图5直线的斜率和τ0可得到不同温度条件下EGCG与RBP相互作用的Ksv和Kq，结果见表2。当相关系数≤0.98时，表明在这一系列浓度下可能存在动态和静态混合的淬灭机制[15]。如图5所示，Stern-Volmer曲线在低EGCG浓度时线性相关，高EGCG浓度时逐渐偏向y轴，说明同时存在静态和动态淬灭[6]，并且Ksv随着温度的升高而有所增大，说明EGCG淬灭RBP内源荧光的机制存在因分子间碰撞导致的荧光淬灭，即动态淬灭。同时，由于不同温度曲线下的Kq远大于最大动态猝灭速率常数[约为2×1010L/(mol·s)]，表明EGCG 对RBP的猝灭机制也存在因分子间生成不发光基态复合物的静态淬灭，结合其荧光光谱和紫外-可见吸收光谱出现的变化分析，静态淬灭在EGGC对RBP的荧光淬灭过程中起主导作用[16]。相关研究同样发现EGCG与β-乳球蛋白[17]和鲢鱼肌球蛋白[18]相互作用时同时存在静态荧光淬灭和动态荧光淬灭。

图5 不同温度条件下EGCG对RBP荧光猝灭的Stern-Volmer方程曲线图

表2 EGCG-RBP复合物的荧光淬灭常数及相关系数

2.3.2 EGCG-RBP复合物的结合常数、结合位点数及作用力

当小分子独立地与大分子上的位点结合时，结合常数(KA)和结合位点数(n)可以通过以下等式确定[19]：

(2)

式中：F0表示没有猝灭剂时的荧光强度；F表示有猝灭剂时的荧光强度；KA为表观结合常数；n为结合位点数；[Q]为猝灭剂的浓度。

图6显示log [(F0-F)/F]对log [Q]的双对数曲线，由拟合曲线的斜率和截距得到n和KA(表3)。从表3中可以看出，结合常数KA的数量级达到106，而相关研究表明EGCG与牛血清蛋白[6]、β-乳球蛋白[7]和鲢鱼肌球蛋白[18]相互作用的KA数量级分别为104、104和105，小于本文EGCG与RBP的相互作用KA数量级，表明EGCG与RBP之间的结合力较强，这可能是由于RBP与牛血清蛋白、β-乳球蛋白和鲢鱼肌球蛋白结构差异引起的。KA值随着温度的升高而增大，也表明EGCG与RBP相互作用时存在动态淬灭。在不同温度条件下n均约等于1，表明EGCG与RBP有1个相对独立的结合位点，且n值随温度的变化不明显，同样表明EGCG与RBP发生了较强的相互作用，类似现象在茶多酚与大豆分离蛋白[11]、EGCG与β-乳球蛋白[17]、EGCG与鲢鱼肌球蛋白[18]相互作用的研究中也有报道。

图6 不同温度条件下EGCG荧光猝灭RBP的双对数曲线

表3 EGCG-RBP复合物的结合位点数、表观结合常数及相关系数

小分子和蛋白质之间的结合力主要包括疏水相互作用、静电引力、范德华力、氢键等，热力学参数ΔH和ΔS是确认作用力的主要依据。当ΔH<0、ΔS<0时，分子间的作用力主要是氢键和范德华力；当ΔH>0、ΔS>0时，分子间的作用力主要是疏水相互作用；当ΔH<0、ΔS>0时，分子间的作用力主要是静电引力；当ΔH>0、ΔS<0时，分子间的作用力主要是疏水相互作用和静电引力[7]。可由Van’t Hoff方程[7]判定EGCG与RBP之间的作用力类型。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

式中：R为气体常数8.314 J/(K·mol)；T为实验的温度；KA为在相应的温度(290、300 K和310 K)下的结合常数。计算结果如表3所示。

以lnKA对1/T作图，ΔH和ΔS值分别从曲线的斜率和截距计算。由表4可知，ΔG<0，说明EGCG与RBP的结合可以自发进行。该反应的ΔH>0，表明EGCG与RBP之间的相互作用为吸热反应，升温有利于反应的进行，这与结合常数KA随着温度的升高而逐渐升高相吻合。ΔH>0、ΔS>0说明EGCG 与RBP之间的作用力主要为疏水相互作用。

表4 不同温度下EGCG与RBP相互作用的热力学参数

2.3.3 EGCG与RBP的能量转移和结合距离

根据Föster’s偶极-偶极非辐射能量转移理论[7]，蛋白质和小分子配体之间发生能量转移应该满足以下条件: ①蛋白质能产生荧光；②小分子配体的紫外光谱和蛋白的荧光发射光谱发生重叠；③给体和受体的结合距离小于7 nm。综合EGCG与RBP的荧光光谱和紫外-可见光谱，由式(5)～式(7)可计算EGCG与RBP的重叠积分J、能量转移效率E、结合距离r及临界能量转移距离R0[16]。

(5)

(6)

(7)

式中：F(λ)为蛋白在波长λ处的荧光强度；F和F0分别表示有和无猝灭剂时蛋白的荧光强度；ε(λ)则为小分子配体在波长λ处的摩尔消光系数；J为蛋白质的荧光发射光谱与配体的吸收光谱之间的光谱重叠积分；R0是指能量转移效率E=50% 时的临界距离；r为结合的配体与蛋白质之间的距离；K2为偶极空间取向因子(取值 2 /3)；N为介质的折射指数(取值 1.336)；Φ为给体的光量子效率(取值0.118)。

由图7根据式(5)计算得J=3.984 8×10-17cm3·L/mol，E=0.767 1，R0=0.976 3 nm，r=0.800 4 nm。结合距离远远小于7 nm，而且结合距离符合0.5R0

图7 EGCG紫外吸收光谱和RBP荧光发射光谱重叠图

2.3.4 EGCG与RBP结合率的预测

EGCG-RBP结合率是EGCG与RBP结合的量占EGCG总浓度的百分比，它是反应EGCG与RBP相互作用的重要参数之一。当EGCG和蛋白质的结合达到动态平衡时， 根据结合常数和结合位点数接近1，可以建立EGCG与RBP结合率的理论模型。结合常数(KA)和结合率(Y)之间的关系可以通过式(8)描述[13]:

(8)

式中:Y是结合率；KA是不同温度下的结合常数；X是EGCG与RBP的浓度比；P是RBP浓度。根据实验结果，运用式(8)分别计算了不同温度下的不同浓度的EGCG的RBP结合率(图8)。

图8 不同温度条件下EGCG与RBP的结合率

由图8可知，EGCG 的RBP结合率表现出明显的浓度依赖性，EGCG与RBP结合率随着EGCG浓度的增大而减小，温度变对两者的结合率几乎不产生影响。图8中还完整描述了EGCG浓度与RBP浓度动态变化时两者之间结合率的全程规律，温度290、300、310 K时的曲线方程为：

(9)

(10)

(11)

因此，可以通过测定RBP和EGCG浓度，由式(9)～式(11)计算其结合率，EGCG与RBP结合率可能对RBP消化性质产生影响[20]。

3 结论

采用荧光光谱和紫外-可见光谱法研究了EGCG与RBP之间的相互作用，内源荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和紫外-可见光谱均证实，EGCG与RBP之间存在较强的相互作用，形成了不发光的基态化合物，并且EGCG与RBP相互作用时，主要影响的是色氨酸残基在空间结构中所处的微环境。通过进一步对EGCG与RBP的相互作用机制进行研究，结果发现，EGCG引起的RBP荧光淬灭现象是动态猝灭和静态猝灭共同作用的结果，但以静态淬灭为主。EGCG与RBP的结合常数KA的数量级达到106，表明EGCG与RBP之间的结合力较强。EGCG 与RBP反应的热力学参数ΔH和ΔS均大于0，说明两者之间的作用力主要为疏水相互作用。同时，EGCG与RBP之间存在能量转移，结合距离r非常小，也表明两者之间具有较强的相互作用。最后，本文还建立了EGCG与RBP结合率的理论模型，发现EGCG与RBP结合率随着EGCG浓度的增大而减小，温度变化对两者的结合率几乎不产生影响。