小米发糕发酵剂中乳酸菌的筛选及其在小米发糕中的应用

张桂英 朱 静 张喜文 师俊玲 曲 睿 杜文娟 姜龙波 李 萍

(山西农业科学院谷子研究所1，长治 046011)

(信阳农林学院食品学院2，信阳 464000)

(空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室; 西北工业大学生命学院3，西安 710072)

小米营养丰富，含有蛋白质、矿物质、维生素及钙磷铁等人体必需的营养物质[1，2]，具降脂、降压、滋阴养血、调节睡眠等功效[3]。目前，米发糕[4]和小米糕[5]研究较多，但以小米为主要原料的发糕鲜见报道。小米发糕风味独特、极易消化，是一种深受大众喜爱的粗粮制品。民间生产多采用传统自然发酵方法，主要菌种为乳酸菌和酵母菌。由于多数乳酸菌对人体健康的有益特性及其在国民经济中的重要作用，近年来，利用乳酸菌发酵食品、药品等层出不穷[4]。如何将小米发糕发酵剂中的优良乳酸菌引入市售混合菌剂，将会成为传统发酵剂研究领域的一个创新点[4,6,7]。

米发糕发酵剂中优势菌是酵母菌和乳酸菌。乳酸菌属包括肉食杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、酒球菌属、片球菌属、链球菌属、四链球菌属、魏斯氏菌属[8]。本研究在山西省农业科学院谷子研究所已有的工作基础上[9-11]，从前期选育的优良小米品种中，通过小米发糕感官评价、理化分析和质构分析等筛选获得5份品质差异较大的小米品种为对象，利用自然发酵法制备发酵剂，通过细菌总数测定和其制备小米发糕品质的感官评价，初步筛选差异较大的2个品种进行乳酸菌的分离。采用乳酸菌传统分离方法，分析了发酵剂中的乳酸菌优势菌群，并通过分离乳酸菌制作小米发糕，测定其对产品风味、品质等的影响，进一步筛选适合小米发糕制作的乳酸菌菌种。为进一步了解传统发酵剂中乳酸菌的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料

发酵剂制备用小米粉：1号[(长农35，国鉴谷2013002)[9]，2号(晋谷56，晋审谷(认)2013002)][10]，6号(长谷4号，国00027992)[11]，8号(M1)，10号(K4)，由山西农业科学院谷子研究选育；乳酸菌对小米发糕品质影响实验用小米粉：“谷谷香”小米面粉；味忆佳绵白糖；新良中劲小麦粉；安琪高活性干酵母。

1.1.2小米粉的制备

小米经除杂后，40℃干燥至恒重后进行磨粉，小米粉过100目筛备用。

1.1.3培养基及主要药品试剂

MRS固体(液体)培养基[4]；TaqDNA聚合酶、D2000Marker；细菌基因组DNA提取试剂盒；其他化学药品均为进口分析纯药品。

1.1.4仪器与设备

T100TMThermal Cycler PCR仪；SW-CJ-2F 超净化工作台；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器；SPX-250生化培养箱；TGL-16C离心机；JC101-2A电热干燥箱；XF-2醒发箱；SH2-82A气流恒温振荡器；TU-1810紫外可见风光光度计。

1.2 方法

1.2.1小米发糕蒸制工艺

参照米发糕的制备工艺进行调整[12, 13]，称取120g小米面粉，加入6g绵白糖之后搅拌均匀，用120mL沸水烫面，然后加入80g中筋面粉，用手和面至光滑，至35℃醒发箱发酵2h，然后观察生面团的形态和发酵速度。取发酵面团每50g塑性，然后进行30min二次醒发，凉水上锅，电磁炉1300W到锅盖发热，调制1600W到出汽，再蒸制30min。

1.2.2小米发糕发酵剂中乳酸菌的分离、纯化及筛选

从酵子内部及酵子表面各取面5g，合并转置于90mL 无菌水的三角瓶中(瓶中预先放一定数量的小玻璃珠)，160r/min，30min，使酵子样品尽可能溶解，制成酵子悬液。将酵子悬液依次稀释103～106倍，制成梯度稀释液，混匀后37℃培养48h，挑取不同形态单个菌落，划线接种于MRS琼脂培养基中，37℃培养24h，重复4次纯化乳酸菌。纯化得到的乳酸菌菌株，观察并记录菌落特征并挑取单菌落转接到斜面培养基上，并置于4℃保藏。小米发糕发酵剂中乳酸菌属的鉴定按照文献[14,15]中的方法进行，包括：革兰氏染色；过氧化氢酶实验；葡萄糖产气、产酸实验。

1.2.3乳酸菌对小米发糕品质的影响

(1)乳酸菌的扩大培养：将1.2.2斜面保存的乳酸菌，接种于装有5mLMRS培养基试管中，37℃培养24h，按5%的接种量再接种于100mL三角瓶中，培养结束后，5000r/min离心10min收集菌体，用灭菌蒸馏水清洗3次，4℃保存用于小米发糕制作。

(2)小米发糕制作：按1.2.1方法制备小米发糕，酵母菌与乳酸菌的菌种比例107∶107(数量比)，加入量2%。

(3)指标测定:小米发糕含水量的测定[16]，比容采用菜籽置换法[17]，pH和总酸度(TTA值)测定参照GB5009.239—2016；还原糖含量测定参照GB5009.7—2016。

(4)感官评定:参考文献进行相应调整[13]，制定小米发糕感官评价标准，见表1。小米发糕感官评价方法：在小米发糕蒸制好后2～5h进行感官评定。10位经过训练的评委对切好的1.0cm厚小米发糕样品进行评分。评委中的男性4位，女性6位，年龄在18～35岁范围内。小米发糕的感官评定主要从小米发糕的食用品质指标进行评分(表1)，取其平均值。以小米发糕形态蓬松、色泽金黄均匀、有柔和的发酵味、酸甜适中，口感松软为最高分(满分100分)，总分为各项指标平均得分之和。

表1 小米发糕感官评价标准表

其中，小米发糕体积的测定采用小米置换法[17]。比容(mL/g)= 体积(mL)/质量(g)，取4次测定的平均值作为米发糕的比容。

1.2.4菌株16s rDNA序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，使用1%琼脂糖电泳进行检测，并以此DNA为模板，利用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3’)针对性地对16s rDNA序列进行扩增。PCR反应体系为50μL：10×Buffer5μL、dNTP4μL、MgCl24μL、引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA40～50ng、Ex Taq1.5U、灭菌超纯水补齐至50μL。反应条件为：98℃2min，98℃10s，57℃10s，72℃15s，35个循环，72℃2min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖进行检测。纯化后的PCR产物用ABI3730基因测序仪测序。使用Lasergene软件内部的SeqMan对测序结果进行拼接及引物序列校准。将拼接后的序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对，然后使用MEGA5软件对基因序列及若干近源种的16s rDNA基因进行多序列比对，并使用邻接法进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离源筛选

将在30℃下培养48h的菌落进行计数，并结合小米发糕相应的品质特征，筛选差异较大的两种分离源，结果见表2。

表2 发酵剂中乳酸菌总数和小米发糕的品质特征

从菌落计数结果看，乳酸菌菌落数达到107～109cfu/g，与大多数酸面团的报道结果一致[18,19]。

对采集的小米粉制备的小米发糕样品感官进行评定，由表2可知，6号小米粉制备的小米发糕酸度最大，黏性较大，质硬，弹性较低；2号和10号样品酸味淡，黏度略大，总体弹性低，总体来说，10号比2号品质好，但酸味比2号浓些；8号样品酸味较大，黏度略大，弹性较好；1号样品发糕酸味适中，质地细腻，弹性较好，口感更顺滑柔和。且发现6号面团的发酵速度较其他快，说明同样时间内，其产酸量更大，其他产品发酵速度差异不大。

总体来说，1号样品感官品质较好，6号较差，且面团的发酵速度也不同。不同来源的酸面团中细菌的种类和数量均有所不同[20]，因此选择差异最大的2个发酵剂作为乳酸菌的分离源。

2.2 乳酸菌的筛选

将分离纯化的91株细菌，进行革兰氏染色、葡萄糖产酸产气和过氧化氢酶活性检测，由乳酸菌的特性，认为革兰氏染色阳性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性及过氧化氢酶阴性的菌株为乳酸菌。符合条件的菌株共有33株，初步鉴定为乳酸菌。

2.3 乳酸菌对小米发糕品质的影响

2.3.1乳酸菌对小米发糕含水量的影响

调粉后，含水量高的面团容易被CO2膨胀，因而发酵速度较快，较硬的面团则对气体膨胀力的抵抗能力强，从而使面团发酵速度受到抑制[21]。由图1可知，编号为LA1-46、LA1-28、LA6-34和LA6-40的乳酸菌调制的面团含水量较高(>44%)，发酵速度较快。根据GB7099—2015《糕点、面包卫生标准》、GB/T20977—2007《糕点通则》以及GB5009.3—2016《食品中水分的测定》等的要求，小米发糕的含水量应该在34%～44%之间。含水量的多少，影响着小米发糕的口感，含水量太低的话，嚼起来比较干涩。由图1可知，LA1-28和LA6-34乳酸菌蒸制的小米含水量均大于44%，不符合标准，其余的小米发糕均符合要求，与面团含水量结果一致。但相对来说LA1-46、LA6-35和LA6-40乳酸菌蒸制的小米发糕含水量适中，口感较好。

图1 小米发糕面团(a)和发糕含水量(b)

图2 小米发糕pH值(a)和总酸度(TTA值)(b)

2.3.2乳酸菌对小米发糕pH值和总酸度(TTA值)的影响

小米发糕样品的酸度测定结果见图2。所有样品的pH值处于4.92～6.26之间，TTA值4.9～10.1，国内外鲜有小米发糕相关报道，与国内外已报道的面制品的酸度基本一致[18]。其中，LA6-29乳酸菌对小米发糕面团pH值与TTA值与其他样品相差较大，pH最大，TTA值较低。总酸度(TTA值)的测定可以发现，LA6-39乳酸菌发酵下的小米发糕pH值最小，产酸最多，发酵效果最好。LA1-24乳酸菌发酵下的小米发糕pH值最大，产酸最少，发酵效果最差。乳酸菌除了主要产生乳酸外，还能促使形成多种新的香味物质。但是，如果pH过低也会影响风味和口感。参照GB/T21118—2007，总酸度要求5.6～7.2，LA1-46、LA6-10、LA6-16和LA1-28乳酸菌蒸制的发糕均不符合国际标准。因此，结合小米发糕的感官品质和水分含量结果，LA6-35和LA6-40乳酸菌蒸制的小米发糕风味更好。乳酸菌在发酵过程中，能产生乳酸、醋酸等，降低发酵制品中pH值，并能合成具有抗菌作用的细菌素，这对于抑制发酵食品中致病、致腐菌具有重要意义[22]。

2.3.3乳酸菌对小米发糕糖含量的影响

不同乳酸菌发酵的样品，可溶性糖含量的变化也存在差异，由图3可知，LA6-40乳酸菌发酵的小米发糕还原糖含量最高，LA6-28乳酸菌发酵的小米发糕还原糖含量最低。单一乳酸菌发酵的老面团的样品各可溶性糖含量最高，乳酸菌和酵母菌复配使用次之[23]，乳酸菌可调节面制品的可溶性糖含量，LA6-40乳酸菌对小米发糕还原糖含量影响最大。糖类在小米发糕最终的口感方面影响很大，如果糖度过低，其酸味就过高，所以，结合小米发糕的感官品质和其他结果，LA6-40乳酸菌发酵的小米发糕酸甜适中，风味最好。

图3 小米发糕还原糖含量

表3 乳酸菌发酵下的小米发糕感官评定

2.3.4乳酸菌对小米发糕感官品质的影响

GB/T20977—2007《糕点通则》中对小米发糕的感官指标要求是以小米发糕形态蓬松、色泽金黄均匀、有酒香味、有柔和的发酵味、口感松软、酸甜适中、无粘牙现象、切面有细密针眼且分布均匀、加压后能恢复现状为最高分(满分100分)。由表3可知，经过感官评定发现，LA6-40和LA1-18乳酸菌发酵下的小米发糕总分较高，适宜作为发酵小米发糕复配的乳酸菌，与已有报道结果相同，非小麦粉制品由于面筋蛋白含量较少，在预防腹腔疾病方面具有积极作用，但不宜通过酵母菌发酵，而乳酸菌可很好的解决此问题。例：乳酸杆菌比酵母菌降pH能力更强，短乳杆菌可生成更多的双乙酰，而肠膜样明串株菌可赋予玉米粉高黏度特性，同时这3种菌株制作的玉米面包具有极佳的感官特性[24]。乳酸菌对小米发糕品质的改良的原因可能是其在发酵中产生的蛋白酶可在酸性环境下降解谷蛋白，这种降解可改善面团流变学特性，使面包获得更好的质地[25]；其不仅可产生乳酸，还能生成乙酸、丙酸等其他有机酸，与发酵中生成的醇、酮等作用，生成具有独特风味的其他物质[26]；起到一定的自然防腐效果[27]。Katina等[28]研究发现，采用乳酸菌发酵全谷物面团，不仅能改善面团营养价值，且可为相关保健制品的研发提供参考。

2.4 乳酸菌的系统鉴定

乳酸菌在改良MRS平板上的菌落形态为：直径约1～3mm、圆形、中间突起、边缘整齐、表面光滑湿润、乳白色、菌体黏稠；革兰氏染色镜检为G+短杆菌，短链或成链或成链排列。

以乳酸菌的总DNA为模板，采用细菌16s rDNA通过引物进行扩增，得到单一条带，大小约为1.5kb的特异性扩增产物。并将PCR产物送公司进行序列测定，具有典型的16s rDNA。由图3可知，测序菌株与比对菌株以非常高的置信度处于同一分支上，因此可判定，通过BLAST软件在Genbank中进行序列相似性比对，菌株与相关近缘模式菌株的系统发育树(图4)。由系统发育分析判断，11株菌株归属为食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)(LA1-10、LA1-12、LA1-18、LA1-27、LA1-38、LA6-3、LA6-10、LA6-12、LA6-29、LA6-35、LA6-40)，LA6-8归属为融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)，LA6-39归属为明串珠菌属(Leuconostoc)，LA1-24归属为柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，LA6-16归属为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，LA1-28归属为肠杆菌属(Enterobacter)，LA1-15、LA1-29、LA1-46和LA6-4经过多次建树和其他类别亲缘关系较远。

注：采用邻接(Neighbor-Joining)法和p距离公式进行系统发育分析，括号内为GenBank收录号，每个分支点处的数字为Bootstrap(1 000次抽样)的支持百分率，标尺代表0.1%的序列差异度。

酸面团中分离出乳酸菌50多种，绝大多数是乳杆菌如短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)、融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)等，与报道一致[29]。本研究发现，LA6-40制备小米发糕的综合感官评价最高，经鉴定为食窦魏斯氏菌。其对产品品质改良的主要原因可能是食窦魏斯氏菌产生的胞外多糖可改善荞麦酸面团糖代谢、面包面团面筋网络结构及面包烘焙特性[30]，融合魏斯氏菌也具备同样的作用。植物乳杆菌也用于改善糙米糕等产品品质和风味[31]。

3 结论

采用山西地区五种小米粉样品制备小米发糕发酵剂，其中8号(M1)发酵剂中乳酸菌数最少，6号(长谷4号)乳酸菌数最多。感官评定结果表明，6号小米粉制备的小米发糕酸度最大，黏性较大，质硬，弹性较低，品质最差；1号样品发糕酸味适中，质地细腻，弹性较好，口感更顺滑柔和，品质最好。选择品质差异最大的6号和1号发酵剂作为后续乳酸菌分离源。共分离乳酸菌91株，革兰氏染色阳性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性及过氧化氢酶阴性的菌株33株。经分子鉴定发现，食窦魏斯氏菌(11株)、魏斯氏菌属(18株)和柠檬明串珠菌(4株)，其中优势菌为魏斯氏菌属。乳酸菌对小米发糕品质影响的研究发现，乳酸菌1-6-40发酵制备的小米发糕含水量39.74%，pH6.20，TTA值5.3，还原糖含量2.27g/100g，其感官评分77.1分，其色泽金黄，口感细腻，酸甜适中，咬劲适度，弹性良好。