胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留

周萍 李樱红 尹志红 吕泽田 尹君 王静 徐初

（1 杭州碧于天保健品有限公司，桐庐 311500；2 浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052；3 中国蜂产品协会蜂胶专业委员会，北京 100050）

蜂胶是工蜂采集胶源植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性物质[1]。蜜蜂主要用蜂胶堵塞蜂巢缝隙，以防止有害细菌、病毒或真菌的入侵，保证蜂箱洁净卫生。蜂胶的化学成分复杂，含有多种活性物质，其功效成分主要为黄酮类、酸类、酯类化合物等[2]。《中华人民共和国药典》（2015年版一部）载明蜂胶补虚弱，化浊脂，止消渴；外用解毒消肿，收敛生肌；用于体虚早衰，高脂血症，消渴；外治皮肤皲裂，烧烫伤[3]。蜂胶凭借独特的医疗保健作用，正越来越受到消费者的青睐。蜂胶的活性成分和安全性已成为研究热点。

氯霉素（CAP）是一种广谱抗生素，是预防和治疗蜜蜂细菌性疾病（美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病等）的有效药物。然而，氯霉素易在蜂产品中残留，人们食用后会引起粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血等[4]，美国、日本等许多国家和欧盟都禁止氯霉素在动物源性食品中检出。中华人民共和国农业农村部第193号公告中明确指出，氯霉素禁用于所有食品动物。为了保证国内消费市场和进出口市场中蜂产品的质量，亟须开发方便有效的检测蜂产品中氯霉素残留的方法，以提高蜂产品的质量。

目前关于蜂蜜和蜂王浆中氯霉素检测方法的报道比较多，主要有高效液相色谱-串联质谱法[5-8]、气相色谱 - 质谱法[9，10]、酶联免疫法[11，12]等。然而，目前，尚无蜂胶中氯霉素残留量检测的国家标准，已报道的蜂胶中氯霉素检测方法主要集中在高效液相色谱-串联质谱法[13-15]。其中，周萍等[14]首次报道了液相色谱-质谱联用技术检测蜂胶中的氯霉素残留，为蜂胶企业提供了氯霉素的内控检测方法，杨黎等[15]报道了以蜂胶为主要原料的保健食品中氯霉素残留的检测方法，为蜂胶制品中氯霉素残留分析提供了思路。然而，高效液相色谱-串联质谱法对仪器要求较高，短时间内无法在蜂产品企业中普及应用，而胶体金免疫层析法[16-18]具有简便、快速、灵敏、特异性高等优点，也不需要复杂的仪器，能在短短几小时内检测几十到几百个样品，可适用于大规模快速检测和现场监控产品中药物残留。

由于蜂胶的成分与蜂蜜、蜂王浆有很大差别，基质更加复杂，本文通过合适的前处理手段，首次建立了胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留的检测方法，可指导蜂农对生产的蜂胶原料进行质量控制，为蜂胶收购者提供蜂胶原料或者蜂胶提取物中氯霉素残留量的快速监测与筛查，从而保证蜂胶源头的品质，进而保证蜂胶制品的品质。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Sartorius BS224S电子天平（德国赛多利斯公司），Philips HR2100/40搅拌机（飞利浦（中国）投资有限公司），Philips HP8260电吹风机（飞利浦（中国）投资有限公司）。

氯霉素（chloramphenicol，CAS：56-75-7，纯度＞99.9%）购自美国Sigma-Aldrich公司，乙腈为色谱纯（德国Merck公司），氢氧化钠、高氯酸、氯化钠、乙酸乙酯、正己烷等均为分析纯，水为娃哈哈纯净水或相当者，CAP-203氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板购自杭州南开日新生物技术公司。

蜂胶和蜂胶乙醇提取物由中国蜂产品协会蜂胶专业委员会提供。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 氯霉素标准储备液

取氯霉素标准品10mg，用乙腈定容至10ml，混匀，于-18℃冰箱保存，可保存24个月。

1.2.2 氯霉素标准中间液

吸取适量1.0mg/ml的标准储备液，用乙腈稀释成浓度为0.1μg/ml的标准中间液，于4℃冰箱保存，可保存6个月。

1.2.3 氯霉素标准使用液

临用时吸取氯霉素标准中间液100μl，用娃哈哈纯净水稀释定容至10ml，混匀，即得浓度为1μg/l的氯霉素标准使用液。

1.3 样品制备

取蜂胶原料适量于搅拌机塑料杯中，粉碎30s，取下塑料杯，混合一次继续粉碎30s，如此3～5次，取砂粒状较细的物料用于检测。当胶含量大于30%时，需要冷藏2h再进行粉碎。

1.4 样品处理

向50ml塑料离心管中加入8ml蜂胶溶解液A（5%氢氧化钠溶液）和8ml水，混合均匀，称入蜂胶原料4g（或蜂胶乙醇提取物称取3g），拧紧瓶盖，在掌心上轻轻拍打5min，使蜂胶溶解，加入蜂胶沉淀剂B（20%高氯酸溶液），用力震摇1min，过滤，收集全部滤液。加入0.25ml碱化剂C（80%氢氧化钠溶液），混合均匀，加入16ml乙酸乙酯，充分振荡1min，静置2～5min，吸取上层清液于蒸发皿中，用电吹风机吹干。加入4ml 1mol/l氯化钠水溶液（含5%（V/V）乙醇）使溶解，加4ml乙酸乙酯，充分振荡1min，静置2～5min，吸取上层清液于蒸发皿中，用电吹风机吹干，加入5滴复溶液（氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板自带）反复吹吸蒸发皿上的残渣，直到全部溶解。加入1ml正己烷，反复吹吸样液和正己烷，静置分层2min，样液层待测定。

1.5 测定

1.5.1 具体操作

取出氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板，置于水平台面上，直至恢复至室温。吸取“1.4”中蒸发皿里的全部样液层，加至加样孔中，在10min后目测读取结果。

1.5.2 空白对照

每批样品需做一孔空白对照，以复溶液代替试样提取液，按“1.5.1”进行。

1.5.3 平行测定

设定每个样品的平行样数量≥2，各自按“1.4”和“1.5.1”进行。

1.5.4 检测限试验

称取阴性蜂胶原料样品4g（或蜂胶乙醇提取物称取3g），加入1μg/l的氯霉素标准使用液400μl（蜂胶乙醇提取物样品则加600μl），相当于添加量水平蜂胶原料为0.1μg/kg，蜂胶乙醇提取物为 0.2μg/kg。

注：不同试剂板制造商的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。

2 结果与讨论

2.1 样品净化方法优化

蜂胶溶解液A用于溶解蜂胶中氯霉素和其他水溶性活性物质，蜂胶沉淀剂B用于沉淀蜂胶中的树脂类、蜂蜡等杂质。过滤时，蜂胶原料样品和蜂胶提取物样品的过滤时间因样品不同略有差异。由于不同来源的蜂胶样品差异较大，过滤后的样品或澄清或不澄清，这是因为蜂胶原料中存在某些蛋白质、胶体、杂质，不影响后续操作。

滤液中加入碱化剂后，其有机酸、蛋白质、胶体、酚类、黄酮类化合物形成盐类，此时加入乙酸乙酯振荡，可充分提取氯霉素。由于乙酸乙酯微溶于水，振荡时可能使样液乳化，影响分层效果。经过多次预试验，加入16ml乙酸乙酯可充分保证提取和分层效果，故乙酸乙酯添加量确定为16ml。在静置时管壁可能粘附有样液，吸取乙酸乙酯层时易被误吸入，此时，可以用手轻敲管壁，管壁振动使样液自然落下，再静置几分钟即可吸取乙酸乙酯层。

将乙酸乙酯提取液置于90cm蒸发皿中，用电吹风机吹干。一般胶体金快速检测方法推荐的乙酸乙酯层吹干方法是将液体置于窄口的离心管中，由于管口较窄，不利于热风进入，也不利于乙酸乙酯挥发，比较耗时。本方法将乙酸乙酯层置于敞口的蒸发皿中，方便吹干，实践表明吹干时间平均为6min，速度非常快。

蒸发皿中的残渣只需滴加0.16ml氯霉素复溶液就可以溶解，具体操作时用1ml滴管滴加5滴氯霉素复溶液，先冲洗浸润然后用滴管反复吹吸残留物，浸润过的残留物很容易被溶解在复溶液中。最后，将滴管头部浸在复溶液中，复溶液会全部虹吸到滴管中，全部滴加到氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的加样孔中即可检测。

为了降低方法的检测限，本方法增加了盐析净化过程，大幅度降低了杂质水平，减少干扰，从而降低了本方法的检测限。

2.2 结果及表述

结果判读见图1。

无效：如空白对照控制线（C线）不出现红色条带，说明检测试剂板失效或操作不当，为无效结果，不能进行检测。

阴性：试样检测线（T线）出现红色条带，且颜色比控制线（C线）深或一样深，结果为阴性（蜂胶原料氯霉素残留量＜0.1μg/kg，蜂胶乙醇提取物＜0.2μg/kg）。

图1 结果示意图

阳性：试样检测线（T线）出现红色条带，但颜色比控制线（C线）浅或检测线（T线）未出现红色条带，结果为阳性（蜂胶原料氯霉素残留量≥0.1μg/kg，蜂胶乙醇提取物≥0.2μg/kg）。

2.3 检测限与回收率

分别取0.3μg/l、1μg/l浓度的标准溶液5滴点到试剂板样品孔中，5min后目测，0.3μg/l标准溶液的C线比T线的颜色浅，1μg/l标准溶液的C线比T线的颜色明显更深，所以，试剂板检测氯霉素的灵敏度是1μg/l。

取阴性蜂胶原料样品，分别加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法检验，0.1μg/kg、0.2μg/kg添加时均可得到阳性结果。取阴性蜂胶乙醇提取物样品，分别加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法检验，0.1μg/kg的C线比T线的颜色不能更深，0.2μg/kg添加时可得到阳性结果。由此可见，本方法蜂胶原料检测限为0.1μg/kg，蜂胶乙醇提取物检测限为0.2μg/kg。

按蜂胶原料中乙醇提取物含量为30%计，在本方法检测限以下的蜂胶原料，加工成提取物时，氯霉素残留最高值0.3μg/kg，蜂胶制品中的蜂胶乙醇提取物含量为30%时，可满足限量0.1μg/kg的要求。蜂胶乙醇提取物检测限为0.2μg/kg，蜂胶制品中的蜂胶乙醇提取物含量为50%时，可满足限量0.1μg/kg的要求。

2.4 与质谱结果的一致性验证

取28份蜂胶样品，分别采用本文的胶体金免疫层析法和高效液相色谱-串联质谱法[14]进行检测，结果见表1。由表中可见，胶体金免疫层析法的结果与液质确证结果一致，假阳性率和假阴性率均为0%，说明方法准确可行。

从数据上看，采用本文的胶体金免疫层析法检测到8个阴性样品，说明均在检测限以下，高效液相色谱-串联质谱法检测结果均为＜0.1μg/kg，假阴性率均为0%。采用本文的胶体金免疫层析法检测到20个阳性样品，高效液相色谱-串联质谱法检测氯霉素为0.11～22.9μg/kg，假阳性率均为0%。其中有3个样品T线、C线同时显色，且C线颜色稍深，高效液相色谱-串联质谱法检测氯霉素为0.11～0.13μg/kg，证实氯霉素残留处于较低水平，稍高于检测限而呈弱阳性。其余胶体金免疫层析法检测为阳性的17个样品，高效液相色谱-串联质谱法检测到的氯霉素为0.34～22.9μg/kg，其中0.34μg/kg～0.53μg/kg的样品T线、C线同时显色，且C线颜色明显较深，而0.67μg/kg的样品T线几乎不显色了。综上所述，胶体金免疫层析法与高效液相色谱-串联质谱法检测氯霉素结果完全一致，未出现假阴性与假阳性的情形。

此外，本方法已经经过杭州天厨蜜源保健品有限公司验证，验证样品的检测结果与方法开发者一致。

表1 胶体金免疫层析法和高效液相色谱-串联质谱法氯霉素结果判定表

2.5 检测时间

按本方法检测，单个样品用时约30min，同时检测6个样品，需时2.5h，平均每个样品需时25min。

3 结论

（1）本文首次采用胶体金免疫分析方法对蜂胶及其乙醇提取物中的氯霉素残留量进行了研究。样品在碱性条件下溶解稀释，20%高氯酸溶液除杂过滤后，加入碱化剂适量，经乙酸乙酯提取，盐析净化后，再用乙酸乙酯提取吹干，加入正己烷和复溶液溶解后，用胶体金快速检测试剂板快速检测。结果表明，胶体金免疫层析法对蜂胶及蜂胶提取物中氯霉素残留量的检测限分别为0.1μg/kg和0.2μg/kg。经高效液相色谱-串联质谱确证，假阳性率和假阴性率均为0%。本方法操作简便快速、重复性好、灵敏度高、准确度好，是蜂胶源头收购中监控蜂胶中氯霉素残留量的有效实用的方法。

（2）按本文建立的方法对中国蜂产品协会蜂胶专业委员会的28份蜂胶样品进行氯霉素残留量测定，阴性率仅为28.6%，从结果看，蜂胶中氯霉素残留量情况不容乐观。蜂胶已经被公认为是良好的保健食品原料和中药，需要业内人士借助本检测方法的应用努力解决此安全问题。

（3）氯霉素是动物禁用药物，在蜂产品行业，自2001年以来，氯霉素问题通过业内人士的共同努力，在蜂王浆、蜂蜜等蜂产品原料中已经基本检测不到氯霉素了。蜂胶属于脂溶性物质，与氯霉素有高度的相溶性，由于蜂胶长期粘附在巢框、箱盖中，每次取胶时不能全部从上面取净，导致下次取胶时不同程度留有上次的蜂胶。2010年，周萍等[14]检测到的蜂胶原料中氯霉素残留量远高于本次28个样品，侧面说明我国蜂胶原料中的氯霉素残留量正在逐年减少。

（4）为了解决蜂胶中的氯霉素问题，本文做如下建议：如果蜂群所取蜂胶氯霉素阳性，建议全新更换蜂箱、巢框；蜂农用药时，对蜂药中的禁用药物进行检测，坚决不用含有禁用药物的蜂药；对周边环境、水源进行调查，必要时可以取水样检测氯霉素残留量。