丙泊酚对斑马鱼胚胎运动神经元发育的影响

曹建斌 朱敏淑 曹东航 王明仓 李军

丙泊酚是一种广泛使用的麻醉药，它具有起效快、代谢迅速，使用后患者苏醒平稳、不良反应少等优点，常用于婴幼儿手术的麻醉。和其他常用的临床麻醉药一样，丙泊酚的早期多次接触会增加患儿术后多动症、语言障碍、注意力缺陷和行为异常等风险[1-2]；这些不良反应症状中，很多可能涉及到运动神经元功能的障碍。尽管丙泊酚对运动神经元发育的影响尚未见报道，其潜在的风险并不能忽视。所以，有必要设计和开展严密的科学实验评估丙泊酚对运动神经元发育的影响，以便于指导临床医生对患儿合理使用麻醉药。斑马鱼是一种常见的模式脊椎动物，它具有体外受精、胚胎透明、易于遗传操作等特点，因此常被用来观察胚胎发育，包括运动神经元发育[3]。斑马鱼的基因与人类的基因相似度很高，序列同源性高达87%[4]，所以斑马鱼也常用于临床药物研发与评估[5]。本研究利用标记运动神经元的Tg（hlxb9:mGFP）转基因斑马鱼品系，在活体上观察丙泊酚对斑马鱼胚胎运动神经元发育的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 转基因斑马鱼为Tg（hlxb9:mGFP）品系，由中国科学院神经科学研究所提供。按照Kimmel胚胎分类方法[6]进行实验。将Tg（hlxb9:mGFP）品系斑马鱼饲养在循环水养殖系统中，饲养间保持在14h∶10h的亮暗循环中。在实验前1d 21：00将发育成熟的转基因斑马鱼按雌雄1∶1放入交配缸中（每缸共2条），并用挡板隔开。实验当日11：00拔去挡板，10min后收集胚胎，并将胚胎放入28.5℃恒温培养箱中培养。实验药物为丙泊酚（中国费森尤斯卡比公司），二甲基亚砜（DMSO）、MS-222（美国Sigma-Aldrich公司）。

1.2 仪器 智能光照培养箱（多段编程GXZ型，中国宁波江南仪器厂），斑马鱼养殖系统（中国爱生公司），Nikon SMZ 1000显微镜（日本尼康公司），FV-1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 分组与药物处理 当胚胎受精后8h（hpf），在显微镜下确定胚胎处于相同发育阶段，选择健康的受精卵转入六孔板饲养，每孔放入30个胚胎并加入4ml鱼房系统水。胚胎分为5组，并进行相应的药物处理：A组用20μg/ml丙泊酚处理组，B组用10μg/ml丙泊酚处理组，C组用5μg/ml丙泊酚处理组，D组用DMSO溶剂处理作为对照，E组不作任何处理（空白对照组）。各组药物处理时间从8hpf持续至52hpf，结束后用系统水洗脱药物3次，然后从各组中随机取12个胚胎进行观察分析各组胚胎整体发育状况，取胚胎整体发育正常组的胚胎进行荧光共聚焦成像。

1.4 活体成像观察 将各组斑马鱼胚胎先予0.03%MS-222麻醉3min，然后用1.5%低熔点胶对各组斑马鱼胚胎进行侧躺固定包埋，以便拍照。待包埋胚胎的胶凝固冷却后，在胚胎上方滴上1滴系统水浸没胚胎，然后用激光共聚焦显微镜进行拍照，观察斑马鱼躯干泄殖孔前方8个体节区域运动神经元轴突生长情况，统计各组每条斑马鱼该节段未长出突起的运动神经元比例。按照斑马鱼运动神经元突起的缺失程度进行分类[3]，缺失比例＞80%为重度缺失，缺失比例＜20%为正常，其余为中度缺失。

1.5 统计学处理 采用GraphPad Prism v6.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用非配对双尾t检验；计数资料采用频率（百分率）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚对斑马鱼整体发育的影响 结果表明，A组、B组斑马鱼胚胎形态停滞在原肠胚时期，说明该浓度的丙泊酚有明显的胚胎毒性。发育正常的胚胎比例C组为（78.9±7.0）%，D 组为（84.4±5.1）%，E 组为（87.9±7.0）%，C组与D组、E组发育正常的胚胎比例比较均无统计学差异（均P＞0.05），说明5μg/ml丙泊酚处理不会对斑马鱼的整体发育状况造成明显的影响，因此，本研究可用这一药物浓度处理的斑马鱼来评估丙泊酚对运动神经元发育的特异影响。

2.2 丙泊酚对运动神经元发育的影响 不同胚胎的运动神经元突起生长情况不尽相同，有的胚胎大多数运动神经元都长出突起，有的胚胎很少有运动神经元长出突起。运动神经元突起发育情况见图1，与正常的运动神经元相比，部分神经元发育呈重度和中度缺失。对各组胚胎的运动神经元发育状况进行分析归纳，结果表明，5μg/ml丙泊酚处理导致斑马鱼胚胎运动神经元发育畸形（重度缺失和中度缺失）的比例明显增加（P＜0.01，表1），说明丙泊酚能够影响运动神经元发育。

图1 激光共聚焦显微镜运动神经元缺失程度图（a：方框所示为本实验工具所拍摄运动神经元节段；b：运动神经元发育重度缺失，×20；c：运动神经元发育中度缺失，×20；d：正常的运动神经元，×20）

表1 各组斑马鱼胚胎运动神经元缺失程度比较[个（%）]

3 讨论

临床回顾性研究发现，婴幼儿早期接受全身麻醉和镇静，可导致神经系统功能障碍，包括学习能力下降、认知功能减低等。丙泊酚是目前最常用的全身静脉麻醉药，具有起效快、苏醒迅速及苏醒平稳等优点，广泛应用于婴幼儿全麻诱导和维持[7]。由于哺乳动物胚胎在子宫内发育，丙泊酚对活体胚胎期神经系统发育受到限制。斑马鱼因其胚胎体外受精及发育，通体透明、易于观察等特点，突破上述限制，已广泛应用于神经发育研究，成为研究胚胎期药物神经毒性的首选模式动物。

近来众多研究明确证实，丙泊酚可改变树突棘形态和突触结构来影响神经系统的发育，从而导致运动、学习等功能障碍[8-9]，而对运动神经元生长发育的影响尚未见报道。研究发现，丙泊酚的神经毒性在啮齿类动物出生后7～14d最为敏感。而在神经干细胞的分化、迁移及增殖期间，丙泊酚是否能通过影响轴突的生长来影响神经元的发育尚未见报道，探讨这一问题具有重要意义。本研究表明，丙泊酚处理影响斑马鱼胚胎运动神经元发育，表现为运动神经元未分化细胞增多，轴突不能投射到相应的肌肉。在本研究中，斑马鱼胚胎暴露于5μg/ml的丙泊酚中，胚胎整体发育与DMSO组及空白对照组相比无统计学差异；5μg/ml丙泊酚处理导致斑马鱼胚胎运动神经元发育畸形的比例明显增加（P＜0.01）。因此，5μg/ml丙泊酚暴露对斑马鱼胚胎的整体发育影响与对照组相比无统计学差异，由于正常状况下也有少部分胚胎出现重度缺失和中度缺失的情况，因此笔者推测丙泊酚的作用可能是延迟运动神经元突起的生长。

综上所述，斑马鱼胚胎早期暴露于丙泊酚会引起运动神经元发育的缺陷。这表明丙泊酚作为常用的婴幼儿临床手术麻醉药是存在影响婴幼儿神经系统发育风险的。但运动神经元的发育是一个复杂且精密的过程，丙泊酚影响运动神经元发育的机制还有待深入的探索。