基于TCGA数据库和免疫组化法对整合素β4与肺腺癌的关系研究

徐建峰 沈建飞 朱成楚

肺癌是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤[1]，在我国国民癌症相关死亡中位居首位[2]。肺癌的组织学分型主要包括鳞癌、腺癌和大细胞癌，其中肺腺癌是女性、亚洲人种和非吸烟患者中最为常见的组织学分型[3]，患者预后大多较差[4]。以往临床对肺腺癌的治疗以手术和放化疗为主。目前，靶向药物应用的推广给肺腺癌患者带来新的希望[5-6]。随着对人类基因表达谱的深入研究，通过靶向调控基因来实现肺腺癌精准治疗[7]，以及通过检测基因表达筛选肺腺癌患者和预测肺腺癌患者预后成为了可能[8-9]。

整合素是由α和β亚基形成的二聚体，人类基因组包括18个α亚基和8个β亚基，通过不同的组合可形成24种不同类型的整合素[10]。其中，整合素α6β4在细胞黏附过程中被认为尤为重要[11]。整合素α6亚基可通过与β1和β4亚基结合形成整合素α6β1和α6β4，而β4亚基仅能与α6亚基结合，这意味着β4亚基代表了整合素 α6β4的表达水平[10]，即整合素 α6β4可用整合素β4表示。作为一种跨膜受体，整合素是细胞与外环境之间交流的纽带，同时参与肿瘤的发生、发展[10,12]。当肿瘤发生时，整合素会改变自身与细胞外基质的亲和力[13]。文献显示，整合素 β4 与乳腺癌[14]、膀胱癌[15]、宫颈癌[16]、头颈部癌[17]等多种肿瘤关系密切，并在多种肿瘤组织中表达上调，被证实可与脂质体中的表皮生长因子受体相互作用从而促进细胞的生长和增殖[14]。另有研究发现，整合素β4在非小细胞肺癌，包括肺腺癌中存在过度表达，但在小细胞癌中未被检测到[18]。

基于此，本研究通过分析TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中肺腺癌患者的临床资料和mRNA表达数据，研究整合素β4基因在肺腺癌组织与癌旁正常组织中的表达，和对肺腺癌患者预后的影响；并通过免疫组化的方法，对来自浙江省台州医院的20例肺腺癌患者的肺腺癌组织与相应癌旁正常组织中的整合素β4蛋白进行检测和分析，验证整合素β4对肺腺癌患者的影响，以期为整合素β4成为治疗肺腺癌的靶基因提供依据，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 肺腺癌组织芯片购自上海奥特多生物技术公司。整合素β4一抗和二抗均购自美国Abcam公司。二甲苯、乙醇购自浙江三鹰化学试剂有限公司。柠檬酸盐、PBS、过氧化氢购自福州市迈新生物技术开发有限公司。DAB显色液、苏木素染色液购自上海碧云天生物技术有限公司。FBS购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA数据检索 从TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）下载肺腺癌高通量基因测序数据（HTSeq-Count）和临床数据集，共检索到513例肺腺癌组织和59例正常癌旁组织的mRNA表达数据，以及513例肺腺癌患者的临床资料，并将其纳入本研究。所有整合素β4 mRNA表达数据采用log2进行标准化处理，所有数据均来自有效信息，不包括遗失的数据。

1.2.2 患者与标本 本研究所用的标本为2010至2018年浙江省台州医院收治的病理学检查确诊为肺腺癌的患者组织标本，组织标本由中心实验室规范保存，共20例肺腺癌组织和相应癌旁正常组织纳入本研究。本研究所有组织标本的取得均经过医院医学伦理委员会批准与患者的知情同意。

1.2.3 整合素β4蛋白表达检测 采用免疫组化法对肺腺癌组织和癌旁正常组织标本进行免疫染色。用二甲苯和超纯水脱蜡，将组织放入柠檬酸盐缓冲液，并放置于微波炉中加热处理至沸腾；间断加热4～6次，保持亚沸腾温度10min，随后置于室内中冷却30min；用3%过氧化氢封闭10min，加入10%FBS封闭1h；将组织依次置于整合素β4（1∶100）抗体和稀释的二抗中，在室温下分别孵育2～3h和1h；用DAB显色，苏木素染核，再用盐酸酒精分色，二甲苯脱水后拍取整合素β4染色结果图片，用IPP软件进行灰度值分析。整合素β4蛋白相对表达水平=灰度值（标本）/1 000。最后用Graphpad软件处理数据和图形。

1.3 观察指标 （1）比较TCGA数据库中肺腺癌患者癌组织与癌旁正常组织整合素β4 mRNA表达水平；（2）比较TCGA数据库中不同临床特征的肺腺癌患者癌组织整合素β4 mRNA表达水平；（3）比较肺腺癌患者癌组织与癌旁正常组织整合素β4蛋白表达水平；（4）比较不同临床特征的肺腺癌患者癌组织整合素β4蛋白表达水平；（5）比较TCGA数据库中肺腺癌组织整合素β4 mRNA高表达与低表达患者生存情况；（6）比较肺腺癌组织整合素β4蛋白高表达与低表达患者生存情况。

1.4 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用两独立样本t检验或配对t检验；生存分析的最佳截断值来自X-tile软件[19]分析结果；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中肺腺癌患者癌组织与癌旁正常组织整合素β4 mRNA表达水平比较 见表1。

表1 TCGA数据库中肺腺癌患者癌组织与癌旁正常组织整合素β4 mRNA表达水平比较

由表1可见，整合素β4 mRNA在肺腺癌组织的表达水平高于在癌旁正常组织的表达水平，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 TCGA数据库中不同临床特征的肺腺癌患者癌组织整合素β4 mRNA表达水平比较 见表2。

表2 TCGA数据库中不同临床特征的肺腺癌患者癌组织整合素β4 mRNA表达水平比较

由表2可见，不同性别、年龄、种族、肿瘤位置、M分期、T分期、N分期、肿瘤分级的肺腺癌患者癌组织整合素β4 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌患者癌组织与癌旁正常组织整合素β4蛋白表达水平比较 见图1（插页）、表3。

表3 肺腺癌患者癌组织与癌旁正常组织整合素β4蛋白表达水平比较

由图1、表3可见，整合素β4蛋白在肺腺癌组织的表达水平高于在癌旁正常组织的表达水平，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 不同临床特征的肺腺癌患者癌组织整合素β4蛋白表达水平比较 见表4。

表4 不同临床特征的肺腺癌患者癌组织整合素β4蛋白表达水平比较

由表4可见，整合素β4蛋白在T2～3期肺腺癌患者癌组织中的表达水平高于在T1期肺腺癌患者癌组织中的表达水平，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、种族、肿瘤位置、N分期的肺腺癌患者癌组织整合素β4蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 TCGA数据库中肺腺癌组织整合素β4 mRNA高表达与低表达患者生存情况比较 X-tile软件显示进行生存分析时整合素β4 mRNA表达水平的最佳截断值为14.12，整合素β4 mRNA高表达（≥14.12）与低表达（＜14.12）患者生存曲线比较见图2。

图2 肺腺癌组织整合素β4 mRNA高表达与低表达患者生存曲线比较

由图2可见，肺腺癌组织整合素β4 mRNA高表达与低表达患者5年生存率分别为22.4%、44.1%，高表达患者5年生存率明显低于低表达患者（P＜0.05）。

2.6 肺腺癌组织整合素β4蛋白高表达与低表达患者生存情况比较 X-tile软件显示进行生存分析时整合素β4蛋白表达水平的最佳截断值为7.74，肺腺癌组织整合素β4蛋白高表达（≥7.74）与低表达（＜7.74）患者生存曲线比较见图3。

图3 肺腺癌组织整合素β4蛋白高表达与低表达患者生存曲线比较

由图3可见，肺腺癌组织整合素β4蛋白高表达与低表达患者5年生存率分别为25.0%、57.1%，高表达患者5年生存率明显低于低表达患者（P＜0.05）。

3 讨论

肺腺癌是一种临床常见的恶性肿瘤，患者预后往往不佳，探寻新的靶向基因治疗方法意义重大。本研究中，笔者探讨了整合素β4 mRNA和蛋白表达水平与肺腺癌发生、发展和预后之间的关系。

本研究结果显示，与肺腺癌患者的癌旁正常组织相比，肺腺癌组织中整合素β4 mRNA和蛋白表达水平均明显上调。同时，本研究还显示整合素β4与肺腺癌进展有关。肺腺癌组织中整合素β4蛋白表达水平在T分期较高的患者中明显上调，虽然在TCGA数据库中，整合素β4 mRNA表达水平与T分期之间无明显关系，但是可以看出T3分期的肺腺癌患者癌组织中整合素β4 mRNA表达水平高于T1分期患者，两者单独比较差异有统计学意义。这些结论均支持整合素β4与肺腺癌进展密切相关的观点。

事实上，过去Stewart等[20]研究已经表明，相比于癌旁正常组织，整合素β4在肺腺癌组织中表达上调，且与静脉侵犯存在一定的相关性，并降低了非小细胞肺癌（包括腺癌和鳞状细胞癌）患者的总体生存率。另一方面，已有的文献表明，整合素β4在多种肿瘤组织中表达上调，如膀胱癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌和乳腺癌等。同时在乳腺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌等肿瘤患者中，癌组织中整合素β4高表达的患者预后较差[10]。综合以上研究与本研究结果，笔者认为整合素β4的上调可能与肺腺癌的发生、发展和预后有关。本研究分别从基因和蛋白水平进行验证，且所选的研究组织标本均来自临床患者，因此分析的结论更加具备可靠性，当然另一方面，样本量仍需进一步扩大，并且整合素β4在肺腺癌中的作用机制也需通过动物和细胞实验去验证。综上所述，整合素β4在肺腺癌的发生、发展中起重要作用。整合素β4在肺腺癌组织中表达上调，且整合素β4高表达的患者预后较差。整合素β4或可作为治疗肺腺癌患者新的潜在靶点和预后指标。