绿色木霉和米曲霉混合固体发酵产纤维素酶的工艺条件

付 跃， 柳雨珠， 韦秋艳， 何 麟， 秦文芳， 张玉兰， 覃拥灵*

(1.河池学院 化学与生物工程学院， 广西 宜州 546300； 2.微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室， 广西 宜州 546300)

纤维素是由葡萄糖组成的、不溶于水及一般有机溶剂的大分子多糖，是植物细胞壁的主要组成成分，占植物有机成分的35%～50%，是地球上分布最广泛最丰富的碳水化合物，也是一种可再生资源，全球每年通过光合作用产生的纤维素达20亿t。纤维素降解是自然界碳素循环的中心环节[1]，纤维素降解不仅可以将农副产品和工业废料中的纤维素材料转化为糖，为饲料行业、发酵工业和人类食品提供新的原料来源，同时还可以处理废物、消除公害、保护环境[2]。自然界中微生物降解纤维素往往是多种微生物产生多种酶组分，如内切型和外切型葡聚糖水解酶、β-葡萄糖苷酶(β-G)等协同作用才能完成[3-4]；而产生纤维素降解酶的混合菌一般为2～3种[5-6]。研究表明，微生物中的大多数真菌可产生纤维素酶，如青霉属、曲霉属和木霉属等[7-9]。国内外利用木霉生产的纤维素酶虽然含有高活力的葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶，但β-葡萄糖苷酶酶活低，致使酶水解液中纤维素二糖或其他可溶性纤维寡糖积累，并强烈反馈抑制内切型和外切型葡聚糖水解酶的催化活性[10]。由于天然纤维素酶酶活较低、成本高(占酶糖化纤维材料总成本的25%～50%)，致使纤维素酶应用受限[7]，如用木质纤维素工业化生产燃料乙醇的途径至今仍不能真正实现。因此，开发新的纤维素酶资源，寻找高活性纤维素酶产生菌和新的发酵方法已成为该领域的研究热点[11-13]。

米曲霉被广泛应用于发酵食品(如酱油和清酒等)领域[14]，且被世界卫生组织列为安全菌株[15]。曲霉产的β-葡萄糖苷酶活性高，其与木霉产纤维素酶按适合比例搭配使用可有效提高纤维素的降解效率。张林等[16]研究表明，米曲霉产生的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活性高，可以将内切型葡聚糖水解酶、外切型葡聚糖水解酶作用纤维素之后产生的纤维二糖或可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子并消除纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反馈作用；有些β-葡萄糖苷酶能以葡萄糖为底物合成龙胆二糖或龙胆三糖，龙胆二糖可诱导其他菌种分泌纤维素酶。所以将绿色木霉与产β-葡萄糖苷酶高的米曲霉进行混合培养对弥补绿色木霉中β-葡萄糖苷酶活力的不足、改进整个纤维素酶的酶系结构，进而有效降解纤维素具有重大意义。鉴于此，笔者采用单因素试验和正交试验的方法研究绿色木霉和米曲霉进行混合固体发酵产纤维素酶，旨在为提高纤维素降解效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌种绿色木霉(Trichodermaciride)和米曲霉(Aspergillusoryzae)均保存于微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室。

1.1.2 仪器YM50型不锈钢智能型立式电热蒸气消毒器、GNP-910BS-Ⅲ型隔水式恒温培养箱、SW-CJ-1FD型洁净工作台、CS101-AB型电热鼓风干燥箱、AE240S型电子分析天平、DK2-1型电热恒温震荡水糟、棱光牌722N可见分光光度器、SHA-C型水浴恒温振荡器、BCD-226STC冰箱冷冻离心机、HH-6恒温水浴锅、11020型电子天平、SHA-C型水浴恒温振荡器及CS101-2AB型电热鼓风干燥箱。

1.1.3 试剂葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢、硫酸镁、硫酸铵、无水亚硫酸钠、四水合酒石酸钾钠(酒石酸钾钠)、3，5-二硝基水杨酸(DNS)、琼脂、苯酚、醋酸钠、冰醋酸及氢氧化钠等均为分析纯，市购。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

1) 米曲霉和绿色木霉的培养。米曲霉和绿色木霉甘油种保存于-80℃的低温冰箱中。取出在无菌超净工作台中分别将菌种接到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中，在30℃恒温培养箱中培养3 d。用10 mL生理盐水将活化培养的绿色木霉菌株和米曲霉菌株分别制成1×107个/mL孢子悬浮液或单细胞菌悬液，各取1 mL分别接于100 mL液体种子培养基中，于28℃、150 r/min培养3 d备用。

2) 米曲霉和绿色木霉单菌株发酵产酶。分别将绿色木霉液体种子、米曲霉液体种子各2.5 mL接入装量为25 mL/300 mL的固体发酵培养基中，于28℃发酵培养5 d后取出，按20∶1(V∶W，mL∶g)加入蒸馏水，40℃恒温水浴1 h，8层纱布过滤，6 000 r/min离心10 min，取上清液即粗酶液于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作参照文献[17]的方法分别吸取0.1%葡萄糖标准液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.5 mL置于1～8号比色管中，用蒸馏水补充至1.5 mL，再加2 mL DNS试剂，充分混合后在沸水中煮沸10 min。冷却后用蒸馏水定容至12.5 mL。用分光光度仪于540 nm处测OD值，以1号管为对照。葡萄糖标准样的制备见表1，以葡萄糖的mg数为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

表1葡萄糖浓度标准样的制备

Table 1 Preparation of the standard samples of glucose concentration

项目Item1(CK)2345678葡萄糖含量/mg 00.20.40.60.811.21.5 Glucose contentDNS/mL22222222OD值 OD value00.2750.5340.7861.0161.3001.5351.847

1.2.3 不同因素对混合固体发酵产纤维素酶酶活的影响

1) 混合菌种的接种量比。设4个处理，即在保持混合种子液接种量10%不变的情况下，按米曲霉种子液与绿色木霉种子液体积百分比分别为0与100%，33%与67%，50%与50%，67%与33%，分别接种于装量为25 mL/300 mL的固体发酵培养基中，于28℃发酵培养5 d。每个处理3个平行。重复1.2.2的方法制取粗酶液备用测酶活力(下同)，确定最佳混合菌种的接种量比。

2) 麸皮质量占比。以甘蔗渣为主要碳源，麸皮有利于菌种在初始阶段对碳源的有效利用，为此选择适当的甘蔗渣与麸皮比例对纤维素酶产量非常重要。保持固体发酵培养基麸皮和甘蔗渣总质量为8 g/25 mL不变。设4个处理，其中，麸皮质量占比依次为20%、22%、25%和29%，其余为甘蔗渣质量比。吸取2种霉种子液各2.5 mL接种于装量为25 mL/300 mL的固体发酵培养基中，于28℃发酵培养5 d后制取粗酶液测酶活力，确定最佳麸皮与甘蔗渣质量比。每个处理3个平行。

3) 装量。由于绿色木霉和米曲霉均属于好氧菌株，因此，装量大小对发酵产酶量有影响。根据锥瓶装量(容积)设4个处理，即100 mL、250 mL、300 mL和500 mL，每个处理分别加入25 mL固体发酵培养基，然后接入2种霉种子液各2.5 mL，于28℃发酵培养5 d后制取粗酶液测定酶活力，确定装量对酶活的影响。每个处理3个平行。

4) 培养时间。装量为25 mL/300 mL的固体发酵培养基中加入2种霉种子液各2.5 mL，28℃发酵培养，分别在发酵3 d、4 d、5 d和6 d时制取粗酶液测定酶活力，确定最佳发酵时间。每个处理3个平行。

5) 混合固体发酵产纤维素酶最佳发酵条件的筛选。在单因素试验基础上进行L9(34)正交试验，筛选混合菌固体发酵产纤维素酶的最佳发酵条件。

1.2.4 酶活测定在pH 4.8，温度50℃下，每1 mL纤维素酶液在1 min内能水解底物生成1 mg的葡萄糖，称为1个酶活单位(U)[18-20]。

1) 羧甲基纤维素(CMC)酶。将1 mL 1%(W/V)CMC-Na置于50℃的水浴锅中预热5 min，加入0.5 mL粗酶液，50℃保温反应30 min；然后立即加入3 mL的DNS试剂，用去离子水定容至25 mL体积，沸水浴5 min，用自来水冷却至室温，在540 nm处测吸光值，依据葡萄糖标准曲线计算反应产生的葡萄糖浓度并计算酶活。

2) 滤纸(FPA)酶活。取粗酶液0.5 mL，以50 mg新华滤纸条为底物，加1.5 mL醋酸缓冲液(pH 4.8)50℃恒温反应60 min，后续测定同上。

3)β-葡萄糖苷酶(β-G)酶。取粗酶液0.5 mL，加入1 mL 1%的水杨苷溶液，再加入0.5 mL pH 4.8的醋酸缓冲液，50℃恒温反应30 min，后续测定同上。

1.3 数据统计与分析

试验数据用Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

从图1可见，葡萄糖标准样的浓度与其在540 nm处的吸光度(OD值)之间存在线性关系，其线性回归方程为y=1.295 1x+0.005 1，R2=0.999 2，说明，二者间线性关系良好。

图1葡萄糖标准曲线

2.2 绿色木霉和米曲霉单菌种固体发酵产酶的酶活性

由图2可知，绿色木霉和米曲霉单菌种固体发酵产酶的酶活存在差异。其中，米曲霉产β-葡萄糖苷酶活性较高，是绿色木霉的1.45倍；其羧甲基纤维素(CMC)酶酶活是绿色木霉的1.175倍；绿色木霉滤纸酶(FPA)酶活是米曲霉的1.30倍。纤维素的降解是多种酶混合作用的结果，FPA酶活反应纤维素酶系的综合酶活力，当进行混合发酵降解纤维素时，绿色木霉能够分泌高活性的葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶，此2种酶将纤维素降解为纤维二糖。接种米曲霉后，分泌高活性的β-葡萄糖苷酶，将纤维二糖降解为葡萄糖，解除对内切酶和外切酶的抑制作用。混合菌种发酵较单菌种发酵降解纤维素的效果更好。

图2绿色木霉和米曲霉单菌株发酵产酶的酶活性

2.3 不同因素处理混合菌固体发酵产纤维素酶的活性

从图3看出，不同因素处理绿色木酶和米曲霉2种菌种混合固体发酵产纤维素酶的酶活性存在差异。

2.3.1 混合菌种的接种量比混合菌固体发酵产各酶类的酶活大小随米曲霉种子液体积百分比增加均呈先升后降趋势，且各处理滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活及β-葡萄糖苷酶的酶活力均表现为CMC>β-G>FPA。其中，当米曲霉种子液体积百分比为50%，即米曲霉与绿色木霉种子液接种量比为1∶1时，2种菌种混合固体发酵产FPA、CMC及β-G的酶活力均高于单种菌株产酶的酶活力，此时FPA、CMC及β-G的酶活分别为5.98 U/ml、16.50 U/mL和12.30 U/mL。究其原因是米曲霉产生的β- G酶活性较高，将葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶产生的纤维二糖降解为葡萄糖，解除纤维二糖对葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶的反馈抑制作用。

2.3.2 麸皮与甘蔗渣质量比混合菌固体发酵产各酶类的酶活大小随麸皮质量百分比增加均呈先升后降趋势，且各处理的酶活力均表现为CMC>β-G>FPA。当麸皮质量百分比为25%，即麸皮与甘蔗渣质量比为1∶3时酶活较高，此时FPA、CMC和β-G的酶活分别为6.5 U/mL、20.2 U/mL和14.53 U/mL。

2.3.3 装量混合菌固体发酵产各酶类的酶活大小随锥瓶装量增加均呈先升后降趋势，且各处理的酶活力均表现为CMC>β-G>FPA。其中，当装量为25 mL/300 mL时各酶类的酶活均达最高， FPA、CMC及β-G的酶活分别为7.84 U/mL、19.46 U/mL和15.98 U/mL。说明，装量的大小影响溶氧量，从而影响酶的合成。

2.3.4 培养时间混合菌固体发酵产各酶类的酶活大小随培养时间均呈先升后降趋势，且各处理的酶活力均表现为CMC>β-G>FPA。其中，2种菌种混合发酵4 d时各酶类的酶活均达最高， FPA、CMC及β-G的酶活分别为6.72 U/mL、21.22 U/mL和15.93 U/mL。

图3 不同因素处理混合固体发酵滤纸酶(FPA)、羧甲基纤维素酶(CMC)及β-葡萄糖苷酶(β-G)的酶活性

2.4 2种菌种混合固体发酵的最佳发酵条件

在单因素试验基础上选取米曲霉种子液占比、麸皮质量占比、三角瓶体积和发酵时间进行L9(34)正交试验设计(表2)。从表2和表3可知，影响滤纸酶活的主要因素依次是三角瓶体积>发酵时间>米曲霉种子液占比>麸皮质量占比，其最优发酵条件为米曲霉种子液占比65%，麸皮质量占比30%，三角瓶体积300 mL，发酵时间4.5 d；影响羧甲基纤维素酶酶活性的主要因素依次是米曲霉种子液占比>发酵时间>三角瓶体积>麸皮质量占比，其最佳发酵条件为米曲霉种子液占比50%，麸皮质量占比25%，三角瓶体积500 mL，发酵时间4 d；影响β-葡萄糖苷酶的主要因素依次为发酵时间>麸皮质量占比>米曲霉种子液占比>三角瓶体积，其最佳发酵条件为米曲霉种子液占比50%，麸皮质量占比25%，三角瓶体积500 mL，发酵时间4 d。综上，选择最佳发酵条件为米曲霉种子液占比50%，麸皮质量占比25%，三角瓶体积500 mL，发酵时间4 d进行验证试验，结果表明，FPA、CMC及β-G的酶活分别为5.234 U/mL、22.46 U/mL和16.38 U/mL。

表2 绿色木霉和米曲霉混合固体发酵产纤维素酶的L9(34)正交试验

表3 绿色木霉和米曲霉混合固体发酵产纤维素酶的L9(34)正交试验的均值与极差

注：k1、k2、k3分别为各因素在1、2、3水平时产酶量；R为极差。

Note:k1，k2andk3are the enzyme production with factors at 1, 2 and 3 levels, respectively;Ris the range.

3 结论与讨论

研究结果表明，米曲霉与绿色木霉混合菌固体发酵产纤维素酶的最佳发酵条件：绿色木霉和米曲霉的接种比例为1∶1、装量为25 mL/500 mL锥形瓶、麸皮与甘蔗渣质量比为1∶3、发酵时间为4 d。在此条件下，滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、β-葡萄糖苷酶酶活分别为5.234 U/mL、22.46 U/mL和16.38 U/mL，均高于单菌种发酵。杨林丽[21]筛选纤维素酶产生菌，得到12株菌种，通过拮抗试验舍弃一株，将剩下菌种进行混合发酵，秸秆失重率均高于单一菌种发酵，说明混合菌种发酵能有效提高纤维素酶产量。

混合菌固体发酵产纤维素酶的酶活性高于2种菌种单独发酵的纤维素酶酶活性。说明，混合菌发酵可促使菌种间产酶的协同作用，提高纤维素酶产量及活性。其原因是内切酶和外切酶作用纤维素产生纤维寡糖，高活性β-葡萄糖苷酶能够将纤维寡糖水解成单糖，解除对葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶的抑制，有的β-葡萄糖苷酶能够将生成的过量单糖转化为龙塘二糖或龙胆三糖，同样解除葡萄糖对酶的抑制。

该研究以固体培养基发酵为基础，通过单因素及正交试验方法对混合菌种发酵进行研究，摸索混合菌种最适发酵条件，为其他混合菌种发酵指明了方向。